文献解读 | 关爱婴幼儿健康，Biacore在肠道病毒致病机理研究与药物开发中的应用

肠道病毒（Enterovirus）包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃克病毒及新型肠道病毒，会导致多种人类及哺乳动物疾病，如感冒、手足口病及脊髓灰质炎病等。脊髓灰质炎疫苗预防效果甚佳，但是对其它肠道病毒感染尚缺少特异的控制方法。柯萨奇病毒可通过粪-口途径和口-口途径传播。一般情况下，婴幼儿大多隐性感染；5 岁以下，尤其 3 岁以下儿童，排毒时间可达一个月。病毒感染人体后，可引起上呼吸道感染、急性心肌炎等疾病，对婴幼儿的健康造成严重威胁。在柯萨奇病毒致病机理研究与药物开发中，Biacore 能够大显神威，轻松玩转病毒粒子。

柯萨奇病毒 A10（CV-A10）属于 A 族肠道病毒，作为引发手足口病的相关病原，对全球婴幼儿的健康具有严重威胁。除在患者手、足、口处引起红色疱疹外，CV-A10 的感染还可能导致发热、疱疹性咽峡炎，严重者甚至引发病毒性脑膜炎等。

肠道病毒受体分为介导病毒粘附和脱衣壳两类。2019 年，中科院微生物所高福团队在 Cell 期刊上发表文章，揭示了 B 族肠道病毒通过双受体系统入侵宿主细胞（见扩展阅读）。2020 年，该团队再接再厉，在 PNAS 期刊发表文章，鉴定了含有 Kringle 结构域的跨膜蛋白 1（KRM1）为 A 族肠道病毒入侵细胞的重要受体，并系统地研究了其作用机制以及病毒入侵的过程。

在这篇文章中，研究人员就大量使用 Biacore 检测病毒粒子与相关受体的结合情况。首先，研究人员利用 Biacore 研究了 CV-A10 的成熟病毒粒子与 KRM1 受体在中性（生理条件）及酸性（内吞体条件）环境下的相互作用。CV-A10 成熟病毒粒子通过生物素化修饰，固定在 SA 芯片上，固定量约 6000RU。KRM1 的可溶胞外结构域及其 D90A，W106A，Y165A 突变体使用 PBST 缓冲液进行梯度稀释后，依次进样 1 min，解离 2 min，通过参比通道及 0 浓度进行双扣减保证数据质量。在每次进样后，使用 3M MgCl2 进行芯片表面再生。

实验结果表明，KRM1 胞外区（23-373）在 pH7.4 以高亲和力（KD = 42nM）特异性的结合成熟 CV-A10 病毒粒子（图 1A），而不结合空粒子（图 1B）。结果佐证了 KRM1 是细胞表面介导病毒粘附的受体，且空病毒粒子因不与该受体结合，所以不具有传染性。由于许多肠道病毒通过内吞体途径进入宿主细胞，在酸性条件脱衣壳。研究人员也测试了 pH5.5 条件下 KRM1 与成熟 CV-A10 病毒粒子的结合，虽然相较中性条件亲和力稍稍降低（KD = 210nM），但 KRM1 在酸性环境下也能高效的结合成熟 CV-A10 病毒粒子（图 1C），暗示了 KRM1 也可能在内吞体内作为脱衣壳受体。

随后，研究人员利用冷冻电镜技术，解析了 CV-A10 病毒与 CV-A10/KRM1 复合物在中性和酸性 pH 条件下高分辨电镜结构，揭示了 KRM1 与 CV-A10 病毒结合的分子模式。KRM1 通过其 KR 结构域（黑）与 WSC 结构域（橙）同时与病毒表面 VP1（蓝）、VP2（绿）、VP3（红）发生相互作用，横跨由 VP1 蛋白形成的「峡谷」样结构部位（图 2A），并显示出 KRM1 上 3 个重要的氨基酸位点 D90，W106（图 2E），Y165（图 2F）。

为了验证结构生物学分析结果，研究人员分别将 KRM1 的核心互作残基 D90、W106、Y165 替换为丙氨酸。所有的突变体蛋白在体积排阻色谱（ÄKTA + Superdex 200 Increase 10/300 GL column）纯化中均状态良好（图 3D、E、F）。然而 Biacore 检测结果表明，相较于 WT KRM1，这些突变蛋白对 CV-A10 的亲和力显著降低（图 3 H、I、J），证实了它们在与病毒粒子相互作用中的关键地位。

随后，研究人员进一步通过体外实验，模拟生理环境（37 摄氏度，晚期内吞体酸性 pH），证实 KRM1 能够在酸性条件下介导病毒完成脱衣壳。

KRM1 在 CV-A10 入侵过程中发挥了「一石二鸟」（two in one）的功能，同时介导病毒粘附及脱衣壳两个过程（图 4）。

柯萨奇 B 组病毒（CVB）是可导致多种严重疾病的肠道病毒病原体，可通过粪口等途径传播，传染性强，可感染婴幼儿、青年人及成年人，在全球广泛流行。CVB 可引发重要疾病，包括发热、手足口病、腹泻、脑炎、脑膜炎、心肌炎、胰腺炎、急性弛缓性麻痹等，甚至死亡。CVB 感染与近年来发病率不断上升的病毒性胰腺炎、病毒性心肌炎存在密切联系，是导致 I 型糖尿病和青少年心源性致死的主因之一，具有严重的-危害性。但目前尚无 CVB 特效治疗药物和预防疫苗，相关药物的研发是当前肠道病毒研究的重要方向。

厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心的夏宁邵教授团队在肠道病毒研究领域有多年经验，先后在 Nature Communications 2017（见扩展阅读），Science Advances 2018，Nature Microbiology 2019，Cell Host & Microbe 2020 上发表多篇肠道病毒重要病原体 CVA6、CVA10、EVD68 和 CVA16 的研究论文。今年 2 月，他们又在 Cell Host & Microbe 发表文章，阐明了柯萨奇 B 组病毒（CVB）与其脱衣壳受体（柯萨奇病毒-腺病毒受体，CAR）相互作用及变构过程的精细特征，从分子水平上揭示了 CAR 介导 CVB 病毒高效脱衣壳的作用机制与关键位点，并在此基础上发现了可模拟受体作用特征，诱导 CVB 成熟病毒颗粒失稳及崩解的高效治疗性抗体。

在这篇文章中研究人员使用 CVB1 成熟病毒粒子皮下免疫小鼠，筛选以 CAR 结合位点为目标的单克隆抗体。竞争 ELISA 实验表明，单克隆抗体 5F5 以浓度依赖的方式，有效抑制 CAR 与 CVB1 成熟病毒粒子的结合（图 5A），表明 5F5 的结合位点也许重合或接近 CAR 结合区域。然后，研究人员使用 Biacore 8K 研究了抗体 5F5 与 CVB1 成熟病毒粒子的相互作用。他们使用 ProteinA 芯片捕获抗体，将成熟病毒粒子进行两倍梯度稀释后进样，最后使用 10 mM Glycine pH1.5 进行再生。Biacore 检测结果显示 5F5 以高亲和力（17.9 nM）结合成熟病毒粒子（图 5B）。随后，基于细胞的中和实验进一步证实了 5F5 的高中和活性，对 CVB1 301 毒株 IC50 0.11 μg/mL，对 Conn-5 毒株 IC50 1.49 μg/mL（图 5C）。

在此项研究中，Biacore 8K 提供了关键的亲和力数据，并与 ELISA 以及细胞水平的中和实验结果交叉验证。借助 Biacore 8K 与配套的 ProteinA 芯片能够多快好省地完成大量抗体-抗原（病毒粒子）的相互作用及重复验证实验。此外 Cytiva 新推出的 Biacore Insight Evaluation Software, Concentration and Potency Extension 扩展包（29332204）能帮助用户一次实验即可获得亲和力，动力学，EC50 和 IC50 数据，更加方便、快捷、高效的助力药物开发（图 6）。

参考文献：

中科院微生物所，Molecular basis of Coxsackievirus A10 entry using the two-in-one attachment and uncoating receptor KRM1，Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Aug 4; 117(31): 18711–18718.

厦门大学，Cryo-EM structures reveal the molecular basis of receptor-initiated coxsackievirus uncoating，Cell Host Microbe. 2021 Feb 3;S1931-3128(21)00001-9.

扩展阅读：

南开大学，Serotype specific epitopes identified by neutralizing antibodies underpin immunogenic differences in Enterovirus B，Nat Commun. 2020; 11: 4419.

中科院微生物所，Human Neonatal Fc Receptor Is the Cellular Uncoating Receptor for Enterovirus B，Cell. 2019 May 30; 177(6): 1553–1565.e16.

厦门大学，Atomic structures of Coxsackievirus A6 and its complex with a neutralizing antibody，Nat Commun. 2017 Sep 11;8(1):505.