“ABC”强强联手，再发CELL | 助力蝙蝠冠状病毒RaTG13跨物种识别分子机制研究

6 月 18, 2021

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从分子鉴定、样品制备到功能验证，Cytiva（思拓凡）生命科学为广大科研人员提供了完整的解决方案： Amersham IQ800+Typhoon能让你快速看清各种电泳条带；ÄKTA能帮你制备蛋白、核酸等各种生物分子；Biacore作为分子互作检测的金标准，能为你提供小到离子、大到完整细胞等各种生物分子间互作的精确数据。流式细胞术（Flow Cytometry）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞分析和分选的技术。

今天小编和大家分享一个“ABC集团作战”的经典案例，看看ÄKTA，Biacore 8K与Flow Cytometry是如何助力蝙蝠冠状病毒RaTG13的跨物种识别分子机制研究的。

2021年5月24日，中国科学院微生物研究所研究团队联合攻关，在CELL杂志上发表了题为 “Binding and molecular basis of the bat coronavirus RaTG13 virus to ACE-2 in humans and other species” 的研究论文，提示我们要持续对动物源性冠状病毒进行监测，预防新的冠状病毒引发疫情。

在新冠疫情之初，科学家就发现RaTG13是目前发现的基因组序列与新冠病毒最相近的动物来源的冠状病毒。RaTG13是否存在潜在感染人及与人密切接触的动物的风险成为大家关注的焦点。RaTG13与SARS-CoV-2的RBD氨基酸序列有89.3%的同源性。然而，RaTG13 RBD与hACE2的亲和力（KD=3.86 μM）比SARS-CoV-2 RBD（KD=21.1 nM）低出2个数量级（图1）。

图1 Biacore测定SARS-CoV-2 RBD（A）和RaTG13 RBD（B）与hACE2的相互作用

获得与不同物种同源蛋白受体的结合能力，是病毒实现跨种传播的关键环节。因此，研究病毒和不同物种同源蛋白受体的结合，可用于评估病毒的跨种传播潜能、也可为病毒的起源提供线索。作者首先使用流式细胞术测定不同物种ACE2受体与RaTG13 RBD或SARS-CoV-2 RBD的结合。细胞表面表达融合eGFP的ACE2，使用His标签的RBD进行染色，Anti-His/APC抗体检测，MERS-CoV RBD作为阴性对照（图2A）。

图2A 25个ACE2同源蛋白对SARS-CoV-2 RBD或RaTG13 RBD的流式细胞术分析

结果表明

RaTG13 RBD与表达灵长目（human，monkey），兔形目（rabbit），食肉目（cat，fox，dog，raccoon dog），奇蹄目（horse），偶蹄目（pig，wild Bactrian camel，bovine，goat，sheep）ACE2的细胞互作。SARS-CoV-2 RBD也与以上物种ACE2互作，且有更高的荧光信号偏移。此外，SARS-CoV-2 RBD也能与Malayan pangolin（马来亚穿山甲），alpaca（羊驼），intermediate horseshoe bat（中菊头蝠）和big-eared horseshoe bat（大耳菊头蝠）ACE2相互作用，而RaTG13 RBD不能。RaTG13 RBD能结合mouse ACE2，而SARS-CoV-2 RBD不能。两种RBD均不能与rat，least horseshoe bat（小菊头蝠），little brown bat（小型棕蝙蝠），fulvous fruit bat（棕果蝠），greater horseshoe bat（大菊头蝠），lesser hedgehog tenrec（小马岛刺猬）ACE2互作。

随后，为了进一步阐明RaTG13 RBD与不同物种ACE2的相互作用，作者使用Biacore定量研究了它们间的亲和力。25种ACE2同源蛋白（融合mFc）均使用HEK293F细胞上清表达，在ÄKTA系统上使用Protein A affinity column (Cytiva)和凝胶过滤Superdex™ 200 10/300 GL (Cytiva)进行两步纯化。25个ACE2-mFc蛋白均偶联到CM5芯片，流过RaTG13 RBD蛋白浓度梯度。使用Biacore 8K在25度用single-cycle模式得到亲和力（图2B）。

图2B Biacore表征25个ACE2同源蛋白与RaTG13 RBD相互作用，PD-L1作为阴性对照

结果表明

在研究的其他24个物种ACE2中，RaTG13 RBD可以结合18个物种的ACE2。虽然流式细胞结果显示RaTG13 RBD不结合rat，alpaca（羊驼），intermediate horseshoe bat（中菊头蝠），fulvous fruit bat（棕果蝠），greater horseshoe bat（大菊头蝠），但Biacore结果显示RaTG13可以结合这些ACE2，亲和力在十微摩量级（11.42到38.63μM）。值得关注的是SARS-CoV-2 RBD不结合大鼠、小鼠等物种ACE2，但是RaTG13 RBD可以，并且亲和力在μM级别。

研究团队进一步解析了RaTG13 RBD和人ACE2的复合物晶体结构，发现与SARS-CoV-2 RBD相比，RaTG13 RBD结合人ACE2的6个关键氨基酸存在差异。作者分别使用流式细胞术和Biacore从细胞水平定性（图3A）和分子水平定量（图3B）的研究了这6个氨基酸对于相互作用的影响。

WT和突变RaTG13 RBD使用HEK293F细胞上清表达，在ÄKTA系统上使用His-Trap HP column (Cytiva)和凝胶过滤Superdex™ 200 10/300 GL (Cytiva)进行两步纯化。使用CM5芯片偶联不同物种的ACE2-mFc，流过SARS-CoV-2 RBD及WT或突变RaTG13 RBD的浓度梯度。与WT RaTG13 RBD相比，F449Y，L486F，D501N和H505Y突变显示出与hACE2更强的结合，分别提高了3.5，3.1，8.0，4.0倍；而Y493Q突变降低了亲和力，Y498Q突变与hACE没有结合（图3B）。这一系列分子互作结果与流式细胞结果高度一致。在RaTG13 RBD的基础上，将6个差异氨基酸同时突变为SARS-CoV-2氨基酸后，RaTG13 RBD结合人ACE2的能力提高至 SARS-CoV-2的水平。

图3 RaTG13参与结合hACE2的关键位点的突变分析，流式细胞术（A），Biacore（B）

围绕RaTG13的另一个重要的科学问题是，它与SARS-CoV-2的免疫原性差别有多大？以及目前研发的COVID-19疫苗和抗体药物是否可用于未来可能发生的RaTG13感染的治疗？进一步研究发现COVID-19康复者血清中存在交叉识别RaTG13 RBD的抗体，且可以有效中和RaTG13的假病毒感染（图4C）。

为了进一步测试SARS-CoV-2 RBD单抗对RaTG13 RBD的交叉反应，作者测试了7个SARS-CoV-2 RBD单抗的亲和力。7个单抗均使用HEK293F细胞上清表达，在ÄKTA系统上使用Protein A affinity column (Cytiva)和凝胶过滤Superdex™ 200 10/300 GL (Cytiva)进行两步纯化。7个重组抗体（2 μg/mL）使用Protein A芯片在Flow cell 2捕获500RU，Flow cell 1作为阴性对照。流过SARS-CoV-2 RBD或RaTG13 RBD蛋白浓度梯度。使用Biacore 8K在25度用single-cycle模式测量亲和力（图4D），抗体用10mM Glycine-HCl (pH1.5)再生让Protein A芯片实现多次高效实验。

研究发现

CB6结合RaTG13 RBD亲和力最高（39.1 nM）；REGN10933，REGN10987，C110和B38结合RaTG13 RBD的亲和力相比SARS-CoV-2 RBD降低了100-10000倍；与SARS-CoV-2 RBD高亲和力结合的H4和S2H14，不与RaTG13 RBD互作。后续的流式细胞术（图4E）与假病毒中和实验（图4F）也证实了研究团队前期开发的COVID-19治疗性抗体CB6对RaTG13的活性。

图4 SARS-CoV-2与RaTG13的交叉免疫反应

在这项研究中，流式细胞术可以在细胞层面检测病毒与受体/抗体之间的相互作用，而当需要对相互作用定量研究时，就需要用ÄKTA对ACE2同源蛋白、RaTG13 RBD及突变体，SARS-CoV-2 RBD单抗进行亲和-凝胶过滤两步纯化，然后用Biacore 8K用single-cycle模式方便快捷的得到多组（100对）亲和力数据。特别是Biacore 8K 特有的16通道设计，能够在同一芯片上同时检测8种不同分子间的互作，并且每小时可以检测十几对样品。这样既提高了检测效率，又提高了不同样品间的可比性。细胞水平定性，分子水平定量，相互印证，辅以复合物的结构与假病毒实验，得到可靠的高水平结果。

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自 1990 年上市至今，Biacore 已经成为分子互作检测的金标准，并成功助力基础科研与药物开发的多个研究领域取得重大突破。截至目前，借助 Biacore 累计发表的文章已突破 50,000 篇，超过 80% 的已上市的抗体药物的研发、申报、生产过程中也均有 Biacore 的身影。此外，Biacore 可检测样品的范围十分宽泛，除了常规的蛋白、多肽、抗原、抗体、核酸、有机小分子之外，分子量超高的蛋白复合体、多糖、纳米材料、高分子材料、甚至完整的细胞、细菌、病毒等也同样能够检测，并给出漂亮的数据。

参考文献：

1.中科院微生物研究所

Binding and molecular basis of the bat coronavirus RaTG13 virus to ACE-2 in humans and other species

Cell. 2021 pre-proof

更多ÄKTA、Biacore与Flow Cytometry联合应用的文章请参考扩展阅读。

扩展阅读：

1.中山大学附属第五医院，暨南大学

A SARS-CoV-2 antibody curbs viral nucleocapsid protein-induced complement hyperactivation

Nat Commun. 2021 May 11;12(1):2697.

2.深圳第三人民医院，清华大学

Human neutralizing antibodies elicited by SARS-CoV-2 infection

Nature. 2020 Aug;584(7819):115-119.