“新”肝宝贝 — Biacore助力肝病治疗新靶点发现

2021年7月28日是第十一个“世界肝炎日”，国家卫生健康委疾控局确定2021年的宣传主题是“积极预防，主动检测，规范治疗，全面遏制肝炎危害”，旨在号召公众积极主动接种肝炎疫苗，主动进行体检了解肝脏健康状况，慢性病毒性肝炎患者接受规范的抗病毒治疗，全面遏制病毒性肝炎对人类健康的威胁，公众再次把关注点投向了肝病。

肝病是指发生在肝脏的病变，包括乙肝、甲肝、丙肝、肝硬化、脂肪化、肝癌、酒精肝等等多种肝病。作为一个肝病大国，中国慢性肝病患者人数惊人，据相关数据统计，2020年包括慢性肝炎、脂肪肝和肝硬化在内，中国慢性肝病患者人数可能超过4.47亿。

在临床中，很多慢性肝病患者并没有遵医嘱进行正规的治疗，殊不知在潜移默化中肝脏已经产生肝纤维化症状。肝纤维化是指细胞外基质在肝脏组织内过度增生，导致肝脏结构和功能异常的一组临床和病理学综合征。凡是各种能造成肝脏慢性损伤的原因，都可以引起肝脏的纤维化。如果损伤因素长期不能去除，肝纤维化的长期持续就会发展成肝硬化甚至肝癌。但是否出现肝纤维化就代表宣判“死刑”了呢？其实不然。通过相关研究发现，肝纤维化并不是不可改变的，而是一种可逆的病理过程，是肝病恶化的关键转折点。那么如何把握住这次机会呢？如何抑制肝纤维化呢？所有进行肝病研究的医生、研究人员们都在为之积极努力。

2019年，上海中医药大学附属普陀中心医院的刘成研究员团队，在胃肠病和肝脏病学科的顶尖期刊Gut（IF =23.059 ）上发布了题为“Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mediates hepatic stellate cell activation via ALK5/Smad signalling”的文章，揭示肝纤维化的重要信号通路，为肝纤维化患者提供了全新的治疗靶点。

该团队发现了胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF) 在肝纤维化中，并非通过传统与GDNF家族受体α-1(GFRα-1)及酪氨酸激酶（Ret）结合发挥作用，而是通过与蛋白激活素受体样激酶5（ ALK5）结合，随后激活下游Smad信号通路，促进肝星状细胞（HSCs）活化和肝纤维化（图1）。作为分子互作金标准的Biacore，在证明GDNF与ALK5结合的重要环节上起到关键作用。

胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)是众所周知的神经细胞营养因子，GDNF在一些脑科疾病与其他疾病中的功能均被进行研究，而目前对其在肝损伤中的作用了解有限。研究人员在实验中证明，在肝脏内GDNF通过激活HSCs对肝纤维化有着直接影响。已有研究表明，GDNF通过与受体GFRα-1及Ret形成功能受体复合物后，才能激活下游信号通路，发挥生理功能。然而在该研究中，研究人员发现在GDNF诱导的HSCs激活中，只有Ret是必需受体，而GFRα-1不是必需的。那么在肝脏中GDNF的必需受体到底是什么呢？

GDNF是TGFβ超家族成员，由于TGFβ可通过与ALK5结合，随后通过Smad2/3的磷酸化激活下游信号通路，调控靶基因表达，从而介导其对肝细胞的多功能作用。因此，研究人员假设GDNF可能通过ALK5诱导HSCs活化，初步实验验证GDNF对HSCs的激活确实可以被ALK5抑制剂抑制。

为了直接证明ALK5是全新的GDNF受体，该团队通过使用Biacore T200将GDNF固定在CM5传感芯片上，并将ALK5作为分析物进行亲和力/动力学检测。如图2 所示，ALK5与GDNF的结合呈浓度依赖性，表现出快结合-快解离过程，拟合得到GDNF与ALK5结合的KD值为85.47nM。两者的高亲和力直接证明了，ALK5是GDNF的必需受体。在后续的实验中进一步证明，GDNF需要与ALK5结合后，与Ret形成复合体，才能激活Smad2/3和AKT下游信号通路诱导HSCs活化并产生肝纤维化。

该研究是首个表明GDNF可以通过ALK5/Smad通路诱导HSCs激活的报道，对解释肝纤维化信号通路具有指导性意义。后续研究人员通过GDNF阻断实验，证明其可抑制纤维化进展。基于这些发现，GDNF可能成为未来治疗肝纤维化的一个有吸引力的治疗靶点，为肝纤维化患者可以得到尽早治疗提供可能，在源头抑制肝病恶化。

在该研究中，他们首先通过动物实验和细胞实验，确定了GDNF与肝细胞损伤的相关性及其生理和临床意义，然后再利用Biacore等在分子水平上对GDNF与ALK5的结合进行了验证。值得注意的是，GDNF与ALK5相互作用的信号值非常低，只有几个RU(RMS)，这已经达到其他检测技术的极限，很难获得准确结果。而Biacore T200所特有的超高灵敏度(<0.03RU)，高于其他同类技术两个数量级以上，即使在低信号下，也能稳定检测结合信号，获得真实准确的结合数据，为研究提供有力证据。

除此之外，近年来还有多篇文章在肝癌以及肝病研究中使用Biacore获得了关键结果：

• 东方肝胆医院的王红阳教授使用Biacore揭示4-丙基丁酸（4-PBA）潜在的促肝癌机制；
• 中科院青岛海洋所的孙超岷研究员团队，使用Biacore确定了海洋细菌胞外多糖EPS11在肝癌转移中的作用；
• 在上海交通大学和中国药科大学联合发表的一篇文章中，研究人员使用Biacore发现靶标胱硫氨酸β合酶(CBS)的抑制剂CH004可以显著抑制肿瘤生长；
• 北大清华联合实验室使用Biacore研制了靶标成纤维细胞生长因子19 (FGF19)的抗体药物G1A8/HS29，对肝癌细胞（HCC）有着显著的治疗效果等等。

作为分子互作的金标准，Biacore在三十多年的沉淀中，为肝病/肝癌机制研究、抑制剂发现、抗体药物发现等领域提供技术支持，为人类健康提供了核心助力。