助力攻克重症医学难题 —— Biacore在脓毒症机理研究与药物开发中的应用

脓毒症（Sepsis）是感染引起的全身炎症反应综合征，发病率和死亡率都很高，每年全球有超过 1900 万的人患上脓毒症，病死率超过了 25%。

在革兰氏阴性细菌感染过程中，细菌来源的内毒素（LPS）能引起组织因子的表达与活化，从而快速启动凝血反应，形成血管内血栓并阻止细菌通过血循环进行传播。但当细菌大量侵入血循环造成全身性重症感染（脓毒症）时，失控的凝血反应将发展成为弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）。DIC 表现为凝血因子的全身性激活，以及全身微小血管内的广泛血栓形成、微循环障碍、最终导致多器官功能衰竭。

然而，脓毒症休克和多脏器衰竭的发病机理尚不清楚，目前在临床上治疗脓毒症的手段也非常有限。因此探索脓毒症致死的关键机制是当前国际重症医学领域的前沿热点，并具有重大的临床价值。

中南大学湘雅三医院吕奔教授团队围绕脓毒症的发病机理及靶向干预开展了系列研究，揭示了脓毒症重要的致病机制，为脓毒症的诊治提供了潜在的生物标志物和药物干预靶点，并针对该靶点进行药物筛选，为今后脓毒症的防治提供了新的思路。

2018 年，吕奔教授团队就在 Immunity 杂志发表文章，揭示了 Caspase-11（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 11）途径在细菌感染引起致死性免疫反应的机制。Caspase-11 是血液循环中的细菌内毒素（LPS）在胞质内的受体，Caspase-11 活化引起大量血管内皮细胞和巨噬细胞发生细胞焦亡（Pyroptosis），最终导致弥散性血管内凝血（DIC）、多脏器功能衰竭和死亡。那么血循环中的 LPS 是如何转运到胞质内，激活 Caspase-11 受体并引发一系列的免疫反应的呢？

研究发现肝脏细胞在脓毒症中能向血循环释放大量的高迁移率蛋白-1（HMGB1），这种蛋白能够与血循环中的 LPS 结合，并通过血管内皮细胞和巨噬细胞上的 RAGE 受体将细菌内毒素高效转运至胞浆中（图 1-A）。在整个过程中作为分子伴侣的 HMGB1 蛋白与 LPS 结合，是启动下游过程的关键性步骤，在这个研究中，研究人员利用 Biacore 直接在分子水平上呈现了这一过程，得到了 HMGB1 与 LPS 结合的实时传感图（图 1-B）。

进一步分析 HMGB1 蛋白的结构发现，其存在两个结合 LPS 的结构域 A-box 和 B-box，通过 Biacore 实验发现，截短的 HMGB1 蛋白（仅包含 A-box 或仅包含 B-box）均不能和 LPS 结合（图 1-C），因此这两个结构域都是 HMGB1 蛋白结合 LPS 所必须的。

2021 年，吕奔教授研究团队又在 Immunity 杂志上发表文章，针对前序研究中发现的 HMGB1-LPS-caspase-11 途径，筛选出肝素（heparin）能高效并选择性地抑制 Caspase-11 活化，并阐明了肝素在脓毒症中能通过抑制 Caspase-11 的活化防止脏器损伤、DIC 发生和死亡的机制。

肝素是一类分子量大小不同的内源性多糖分子的混合体。其中部分多糖分子具有与抗凝血酶等凝血调节蛋白结合的能力，并发挥抗凝作用，是临床上常用的抗凝药物，但在使用时具有出血风险。因此，该研究中同时探索了肝素和无抗凝活性肝素（non-anticoagulant heparin，NAH，化学修饰后的肝素，无出血风险）治疗脓毒症的差异。Biacore 实验表明，改造后的 NAH 确实不能与抗凝血酶Ⅲ反应，失去抗凝血功能（图 2-B）。

他们在研究过程中发现：肝素并不是直接靶向 Caspase-11，而是通过与 HMGB1 结合，阻断 LPS 的胞浆内转运，从而抑制 Caspase-11 活化。Biacore 实验结果表明，肝素和无抗凝活性肝素 NAH 均能与 HMGB1 结合（图 2-A），后续的竞争实验也表明肝素以及 NAH 与 HMGB1 的结合确实阻断了 LPS 与 HMGB1 形成转运复合物（图 2-C）。

本研究中分离了肝素的抗凝作用与抗炎作用，揭示了肝素调节免疫反应的药理学机制。与肝素的作用相同，无抗凝活性肝素 NAH 在脓毒症中同样能靶向结合 HMGB1 蛋白，高效阻断 Caspase-11 介导的致死性免疫反应。同时使用无抗凝活性肝素 NAH 规避了治疗过程中的出血风险，是一种潜在的治疗脓毒症的候选药物。

在上述研究的基础上，吕奔教授团队还针对 HMGB1 靶点开展了小分子抑制剂的筛选，筛选得到的小分子化合物 FeTPPs 能明显改善脓毒症的症状，相关研究成果在 2021 年发表在 Cell Death & Disease 杂志上。

在这个研究中，研究人员使用 Biacore 对 FeTPPs 与 HMGB1 的结合进行了验证（图 3-A）。更是通过设计竞争实验，直观地表明 FeTPPs 的分子作用机制是阻断了 HMGB1 与 LPS 的结合（图 3-B），从而抑制了 LPS 的胞质内转运，起到了治疗脓毒症的作用。