小身材，大用途 | Biacore X100在破伤风毒素中和抗体研究中的应用

破伤风，是由破伤风梭菌引起的急性感染性、中毒性疾病，破伤风梭菌经皮肤或黏膜侵入人体后在缺氧环境下繁殖并分泌破伤风神经毒素（TeNT），导致全身骨骼肌持续性强直和阵发性痉挛，重症患者可出现窒息和呼吸衰竭，甚至引起死亡。尽管破伤风类毒素疫苗（经福尔马林灭活的TeNT）可以产生有效的中和抗体反应，并在全世界推广，但破伤风仍然地方性流行于中低收入国家，在孕妇、新生婴儿、未免疫或免疫不足人群中易导致死亡和残疾。

为防止伤口接触破伤风梭菌的潜在风险，需要进行抗毒素治疗。目前马源抗TeNT抗体由于血清病和过敏症的风险，已不在工业化国家使用。尽管抗TeNT人源免疫球蛋白（TIG）更为有效和安全，但它有潜在的血液传播病原体的风险，而且在发展中国家比如中国常常供不应求。所以，亟需一种安全高效的抗TeNT治疗性单抗，用以替代马源抗TeNT抗体和人血清TIG，预防和治疗破伤风梭菌感染。

TeNT有1315个氨基酸，分为A，B，C三个功能片段。50KD的N端轻链（片段A）与100KD的C段重链通过二硫键连接。片段A是毒素的活性部位，有金属蛋白酶活性。片段B是重链的N端部分，负责毒素转运。片段C位于重链C端部分，结合神经元上受体。

2021年5月，暨南大学生命科学与技术学院廖化新课题组在Cell Reports上发表文章。研究者从反复破伤风类毒素疫苗接种的志愿者血液中分离得到32个TeNT特异性天然人源单抗。通过动物实验和ELISA、Biacore等互作手段，最终得到4个潜在TeNT中和单抗，非常有希望开发为治疗性抗体。

志愿者在近40年内，以10年的间隔多次接种破伤风类毒素（TT）疫苗，在最近一次疫苗接种7天后取血。首先，研究者从志愿者血液分离得到单血浆细胞，从中分离得到32个抗TT抗体，并选择17个抗体进行表达纯化进行进一步研究。ELISA实验表明，这17个纯化的单抗都能结合TT和TeNT抗原，3个抗体识别A片段，13个抗体识别AB片段，5个抗体识别C片段。

研究者接着做了动物实验，看17个纯化的单抗是否能中和小鼠体内的TeNT。以抗TeNT人源免疫球蛋白TIG作为阳参。17个单抗中有9个能部分中和TeNT，而TT0067，TT0069，TT0155，TT0170四个抗体，与阳参TIG一致，能完全中和TeNT。

那么这四个有中和作用的单抗与破伤风神经毒素TeNT的亲和力如何呢？

研究者通过Biacore实验证明4个潜在的中和抗体在结合TT疫苗抗原的同时，也能结合WT TeNT。由于抗体结合TeNT或TT的亲和力很高，难以解离和再生，作者改用了捕获法。与直接偶联的方法相比，捕获法无需优化再生条件，更加方便快捷。使用人抗捕获试剂盒（BR100839），在CM5芯片上偶联anti-human Fc IgG 6000RU，在2通道捕获单抗200RU，1通道作为参比，流过倍比稀释的TT或TeNT的浓度梯度，30 μL/min进样90s，解离600s，使用3M MgCl2进样30s再生。

结果表明，TeNT以nM级的高亲和力结合所有4个抗体（图1A），相较TT亲和力相似或者更高（图1B）。尤其是TeNT结合TT0067的亲和力KD为1.16×10-9 M，解离速率kd为6.14×10-5 1/s，而TT以更弱的亲和力KD=1.54×10-8 M，更快的解离速率kd=8.35×10-4 1/s结合TT0067（图1A和1B）。

在4个潜在中和抗体中，TT0069，TT0155和TT0170在ELISA实验中结合片段AB蛋白，研究者进一步用Biacore精确表征了他们之间的亲和力。TT0069，TT0155和TT0170分别以1.68×10-10，7.09×10-10和2.59×10-10 M的高亲和力结合片段AB（图2C）。

随后，作者使用Biacore研究了3个结合片段AB的中和抗体的阻断竞争关系。使用His捕获试剂盒（28995056），将anti-His tag抗体偶联在CM5芯片，通过His6-Tag捕获片段AB，依次进样两个抗体（图2D）。结果表明，单抗TT0069对片段AB的结合不会被TT0155或TT0170阻断，反之亦然。而TT0155和TT0170可以部分阻断彼此对TeNT的结合（图2D）。

随后，研究者解析了TT0067与TeNT片段C的复合物晶体结构，并使用ELISA和Biacore研究了片段C上的关键残基W1289，H1293，D1296对结合的重要性（图3）。研究人员仍然使用捕获法，将anti-His tag抗体偶联在CM5芯片，在2通道捕获片段C或其突变体，通道1作为参比，流过倍比稀释的TT0067的浓度梯度，30 μL/min进样90s，解离600s。

结果与复合物结构分析一致：W1289通过疏水作用与TT0067的HCDR1互作，通过范德华力与HCDR3互作；H1293通过盐桥与HCDR3互作；D1296通过氢键与HCDR1和HCDR2互作；三个残基突变成丙氨酸后，片段C与TT0067的亲和力均降低了500-1000倍（图3）。

回顾整篇文章（图4），研究者在取得志愿者血液样品后，使用Ficoll-Paque PLUS分离外周血单核细胞（PBMC），通过流式细胞术（FACS）和RT-PCR得到32个抗TT抗体，从中选择17个进行表达纯化（ÄKTA）。

接下来使用小鼠进行in vivo毒素中和实验，得到中和效果最好的4个抗体。使用Biacore X100表征了抗体与TT和TeNT的结合活性。对于3个结合片段AB的抗体，使用Biacore X100研究了抗体与片段A的结合活性及抗体间竞争阻断的关系。对于结合TeNT片段C的抗体TT0067，通过纯化共结晶解析了复合物的晶体结构，分析互作的关键位点，使用Biacore X100验证了关键位点对于相互作用的影响。

这套成熟的实验流程已运用在多个中和抗体项目的研究（见扩展阅读）。总结来说，Biacore X100在抗体活性表征，竞争阻断分析，关键结合位点分析中均提供了核心数据。

自 1990 年上市至今，Biacore作为唯一被中美日药典收录的分子互作检测“金标准”，已广泛应用到基础科研与药物开发的多个领域。截至目前，借助 Biacore 累计发表的文章已突破 55,000 篇，超过 80% 的已上市的抗体药物的研发、申报、生产过程中也均有 Biacore 的身影。相信有了Biacore助力“产学研”，未来一定会有越来越多的中和抗体药物从研发走向上市。