临床疾病相关的生物标志物分析，用Biacore就对了

近日，我们在☞《FDA：基于SPR建立流感中和抗体筛选的方法》中介绍了如何采用Biacore评估人血浆样品和IGIV产品（intravenous immunoglobulin，静脉注射人免疫球蛋白）中特异性抗流感病毒抗体的方法。今天让我们把目光再次聚焦于【临床疾病相关的生物标志物分析】，看看Biacore如何助力疾病检测、临床诊断、疗效评价和预后判断等环节吧！

图1：长治医学院发表文章截图

2021年，长治医学院预防医学系与长治学院化学系在杂志《RSC Advances》上发表文章《Aptamer based surface plasma resonance assay for direct detection of neuron specific enolase and progastrin-releasing peptide (31-98)》，使用基于适配体的表面等离子共振法直接检测了神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 和原胃泌素释放肽 (ProGRP31-98) 在不同样本来源中的含量，对临床疾病相关的生物标志物分析提供了新的思路。相关实验结果也表明，针对NSE、ProGRP31-98的最小检测限可以分别低至3.9 nM和15.6 nM，基于适配体设计的传感器芯片具有制作简易、快速、低样品消耗、实时检测、高通量和自动化操作等优势。

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实验背景

神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 和原胃泌素释放肽 (ProGRP31-98) 已被公认为是临床检测非小细胞肺癌的可靠的生物标志物。其中NSE常见于神经组织和神经内分泌组织，如若患有非小细胞肺癌，血液中的NSE浓度会有显著上升。ProGRP31-98是由非小细胞肺癌细胞分泌的一类激素分子。精准检测NSE、ProGRP31-98的浓度，对于肺癌的疾病监测、早期诊断、预后判断等，具有重要价值。

适配体是单链的DNA或RNA分子，与目标分子的结合具有强亲和力与特异性特征，常被认为是化学抗体。适配体具有结构简单、可进行化学合成及体外修饰、稳定性强、低免疫原性等优势。并且适配体能与各类分子进行识别结合，例如化学小分子、重金属、蛋白、病毒、细胞等，具有极大的应用潜力。

目前常用于NSE、ProGRP31-98检测的手段基本是免疫法，例如放射性免疫、酶联免疫、电化学免疫实验等。这些方法大多借助抗体进行辅助检测，所以前期的抗体制备需要大量的时间、操作步骤多、数据重复性低等缺点。此外，借助分析型设备 (LC-MS) 进行NSE、ProGRP31-98的含量检测比较耗时，并对操作人员的技术水平有一定要求。

那么适配体+SPR，如何打造高效的检测平台呢？

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实验策略

图2：基于适配体的表面等离子共振法直接检测目标物含量

基于适配体的表面等离子共振法，进行目标物含量测定的关键步骤见图2：

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将生物素标记后的适配体饱和包被于Biacore SA芯片上的实验通道；

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流过一段时间的running buffer，用于基线平衡；

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注入含不同浓度目标物（例如NSE），180 s，会观察到信号 (RU) 上升；

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切换成running buffer，600 s，会观察到信号 (RU) 略有下降；

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最后，注入再生液 (0.5%SDS) 清洗芯片表面，用于下一个目标物的检测；

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设定实验条件

1、芯片制备

图3：针对NSE的适配体NSE-Apt5-5BioTEG包被结果

SA芯片经简单的清洗后，便可以直接流过经生物素标记的适配体NSE-Apt5-5BioTEG，如图3所示，其包被量为170 RU。随后，便可以进行样本测试了。

2、样本测试

图4：NSE (500 nM) 流过已包被适配体的芯片的检测结果

当已知浓度的NSE样本流过芯片表面180 s，其响应值约为53 RU。芯片表面流经running buffer解离600 s后，其响应值下降至30 RU左右。观察图4，可以看出NSE与芯片表面的适配体NSE-Apt5-5BioTEG有高特异性的强亲和力结合。

3、再生测试

图5：芯片表面的再生测试结果

为增加实验方法的耐受性及降低实验成本，该课题组针对实验步骤里的再生环节进行了条件优化。使用300 nM的NSE为测试样本，以0.5% SDS、30 μL/min、30 s为再生条件进行了5轮重复测试，观察芯片表面的基线 (Baseline/RU) 及样本的响应值 (Relative Response Units/RU) ，结果如图5所示，再生条件非常理想。

4、缓冲液优化

图6：优化缓冲液中的Mg2+浓度

相关报道表示缓冲液中的Mg2+浓度会影响适配体的构象及其与目标分子结合，所以该课题组进一步优化了缓冲液中的Mg2+浓度。以500 nM的NSE为测试浓度、0.5% SDS、30 μL/min、30 s为再生条件，对缓冲液环境（1*PBS、pH 7.5、0.1% Tween 20 and different concentrations of MgCl2）进行了测试，观察样品的响应信号值 (Relative Response Units/RU) ，结果见图6：当Mg2+浓度为5 mM时，能产生最大的响应值，所以，该课题组选定在running buffer里添加5 mM的Mg2+。

参考同样的实验逻辑，该课题组也依次筛选出了适合ProGRP31-98定量检测的实验参数，具体结果可查阅此文章原文及对应的补充材料。

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实验结果

图7：NSE（左）、ProGRP31-98（右）纯品，基于适配体进行定量检测的结果汇总

基于适配体的表面等离子共振法，课题组检测了神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 和原胃泌素释放肽 (ProGRP31-98) 在不同样本来源中的含量。图7是NSE（左）、ProGRP31-98（右）纯品的对应检测结果。由图7c（左）可知，当NSE的浓度为3.9 nM~1 μM时，芯片的响应信号与NSE浓度有较好相关性 (R2=0.0987) ；此外，观察图7c（右），可以看出当ProGRP31-98浓度为15.6 nM~1 μM时，芯片的响应信号与ProGRP31-98浓度有较好相关性 (R2=0.9811) 。

图8：血清来源的NSE，基于适配体进行定量检测的结果汇总

将稀释100倍的人血清与不同浓度的NSE进行混匀后上样，观察响应值与NSE浓度的线性关系，结果如图8所示：图8a展示了当NSE浓度为15.6 nM~2 μM时，响应值与NSE浓度有很强的浓度依赖现象。此外，当NSE浓度为15.6 nM~1 μM时，芯片的响应信号与NSE浓度有较好相关性 (R2=0.9963) 。

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实验方案的耐受性测试

图9：不同时间点进行NSE (500 nM) 的结合响应值观察

为探究实验方案的耐受性及持久性，课题组在间隔3个月之后，进行了实验重复，探究了500 nM的NSE流过同一张芯片的结合响应值的变化，结果见图9。经观察，此方案的耐受性十分理想，响应值只有微弱降低。总的来说，基于适配体的芯片传感器具有高稳定性的特征。

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实验小结

经过大量的文献阅读、实验数据分析，长治医学院预防医学系与长治学院化学系联合开发了基于适配体的表面等离子共振法，对神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 和原胃泌素释放肽 (ProGRP31-98) 在不同样本来源中的含量进行了直接检测。

基于适配体的芯片传感器，可对分子间的亲和力、特异性、浓度进行精确定量，并且该芯片可以稳定保存。此方案，不仅适用于纯品的浓度定量，还可以对人源的血液样本进行实时检测，对临床疾病相关的生物标志物分析，具有极大的应用前景。

Biacore设备自带Concentration analysis模块，用于复杂样本中的浓度定量，支持标曲法浓度测定，极大便利了科研人员的实验方法开发！欢迎大家多多使用Biacore并开发新的实验方案哦！

Biacore，

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