Biacore应用指南：抗原特异性IgG亚型检测

过敏原免疫疗法 (Allergen immunotherapy; AIT) 是一种治疗IgE介导的过敏症（例如：变态反应性鼻炎、鼻结膜炎以及过敏性哮喘等）的方法，需要在连续数年内定期给予过敏原。诱导过敏原特异性IgG1和IgG4抗体是这种治疗的标志，这两种亚型已被证明具有阻断活性，即阻止IgE与过敏原的相互作用。

AIT诱导过敏原特异性IgG1和IgG4抗体的可识别的增加，但与每一种IgG亚型总量相比仍然是低水平的。常规使用的定量检测方法可用于检测过敏原特异性IgG4，但不能用于检测IgG1。而且目前也还没有方法在过敏原特异性IgG1和IgG4同时存在时进行定量检测和比较。

如果有了Biacore就可以快速、准确、轻松地完成这一检测和比较啦，接下来，就跟着小编一起看一下如何应用Biacore进行抗原特异性IgG亚型检测。

一

实验方法

检测仪器：Biacore；
传感芯片：CM5；
运行缓冲液：HBS-P+；
流速：10 µL/min；
配体：氨基偶联抗原 (2400RU) ；
血浆样品准备：10000×g离心5 min；4 ℃，使用HBS-P+按照1:20-1:40稀释，并添加10% NSB reducer；
实验条件：血浆样品进样3 min；注射后使用40 mM NaOH（溶解在20%异丙醇中）进行额外清洗；二抗进样时间1 min；
再生条件：Glycine-HCL pH 1.5，进样30 s。

二

实验条件要求

试剂	要求	备注
血浆样品	阳性信号明显（与缓冲液相比较）	可调整血浆样品的稀释倍数，直到获得明确的结合反应信号
	参比通道不做任何处理	可检测血浆样品与参比通道的非特异性结合信号（不在参比通道偶联）
	保证在每个亚型具有相同的结合水平	为了准确比较不同周期的二抗反应
二抗	特异性	使用SPR (Biacore) 或ELISA进行检测
	饱和注入	可能需要优化浓度或上样时间
	高亲和力	可使用低浓度，但确保解离程度最小

三

Biacore检测抗体分型的原则

对于同一个血浆样品进行分型检测，每个亚型只需要一个循环。将过敏原固定在CM5传感芯片上，随后在传感芯片表面流过稀释后的血浆。接下来，流过抗IgG1抗体，然后表面再生，在第二个循环中再次流过血浆，随后再流过抗IgG4抗体（如图1的Cycle 1和Cycle 2所示）。

图1：Biacore检测抗体分型的原则

将血浆样品流过传感芯片表面，在不同的循环中达到相同的结合水平，并在开始流过二抗之前建立基线，在流过二抗后设置报告点以评估其结合水平（基线和报告点为Biacore自动设置，不需额外操作），由此可以计算出过敏原特异性IgG1和IgG4之间的比例（如图2所示）。

图2：实验检测传感图示例（循环1和2的叠加）

四

实验结果

在AIT开始后的不同时间点，从同一个体采集血浆样本，通过Biacore进行IgG1和IgG4分型（如表1所示）。在AIT第一年IgG1占主导地位；经过1.5年的AIT，过敏原特异性IgG1和IgG4的水平是相等的；而在较晚的时间点会存在更多的IgG4而不是IgG1。

表1：过敏原免疫治疗中的过敏原特异性IgG1与IgG4的比例

Month of Mreatment	3	6	12	18	24	30	36
Anti-IgG1 (RU)	178	230	235	121	65	64	84
Anti-IgG4 (RU)	19	34	58	122	98	94	135
Ratio IgG1:IgG4	9.4	6.8	4.1	1.0	0.7	0.7	0.6

五

与ELISA结果比较

IgG1与IgG4的比例同样使用ELISA进行评估。过敏原包被到ELISA板上和血浆样品进行孵育。单克隆过敏原特异性IgG1和IgG4的抗体作为标准，且与Biacore实验使用相同的二抗。经过两种方法的检测得到了相同的检测结果（如图3所示）。

图3：Biacore和ELISA两种方法测定过敏原特异性IgG1和IgG4的比例

六

结论

Biacore的检测原理表面等离子共振技术SPR作为被中美日三国药典收录并推荐使用的非标记分子互作检测方法，早已成为了分子互作检测的“金标准”。随着Biacore技术的不断更新，以及大家对分子互作检测应用的需求日益增加，Biacore适用的应用方向也越来越广泛。

例如在该应用中就利用Biacore实现了对抗原特异性IgG亚型的检测，且Biacore与传统方法相比较有以下明显优势：

1

可在过敏原特异性IgG1和IgG4同时存在时进行检测和比较，灵敏度更高，检测限更低；

2

在同一检测中可以检测到多种亚型抗体，每个循环即可检测一种亚型，仅需几分钟的时间即可实现准确且快速的检测；

3

可以直接对粗样品进行检测，例如血浆、血清、细胞上清等样品；

4

与ELISA方法的结果可保持高度一致，且可实现无标记、全自动以及更高通量的实时检测。

Biacore至今为止发表的文章数量已经超过了60000篇，其中应用方向包括但不限于：靶点结合验证、分子库筛选、特异性、选择性、结合动力学、结合亲和力、功能复合体形成机制、药物在靶时间评估、结合表位、抗体亚型鉴定、DME、药物代谢浓度 (PK) 、生物标志物浓度 (PD) ，抗药抗体ADA（生物药物免疫原性）等诸多方面数据，满足基础科研、生物药物开发各个阶段的不同要求，在药物发现和开发领域均具有广泛的应用。