G蛋白偶联受体那些事儿

6 月 10, 2022

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引言

G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor, GPCR）是哺乳动物基因组中最大的膜蛋白家族，广泛分布于中枢神经系统、心血管、免疫系统等器官/组织，参与了机体的各项生命活动。

GPCR调控着细胞对激素、神经递质的大多数应答：视紫质保证了视觉，β-肾上腺素受体保证了血糖水平，5-羟色胺受体掌握了人类的幸福密码。同时，GPCR也是药物研发中的关键靶点，目前已获批且靶向GPCRs的药物有475种，占所有FDA批准药物的34%，药物类型涵盖丰富，例如糖尿病、肥胖、阿尔兹海默症等疾病。

但是针对GPCR的新药研发存在着诸多挑战。首先GPCR靶点结构不稳定、表达量低，导致部分蛋白较难获取。纯化得到的蛋白也面临着极易失活、可溶性差的问题，需要添加去垢剂、脂类组分等维持GPCR的天然构象和活性。所以，找到一种既能保证GPCR活性状态，又能对其开展理化性质表征的检测技术尤为关键。Biacore分子互作系统即是采用了一种持续流检测技术，时刻保证GPCR处于溶液状态；无需对分子进行标记处理，减少对蛋白空间构象的影响；缓冲液兼容性高，支持各类去垢剂/脂类的存在。所以，Biacore非常适合于GPCR相关的机制探究、结构信息解读、药物开发等各种分子间的互作实验！

今天，就让我们一起来看看Biacore和GPCR的有趣故事吧！

01. GPCR与机械运动

2021年，华东师范大学等单位在《Journal of Biological Chemistry》发表文章《Structural basis for CD97 recognition of the decay-accelerating factor CD55 suggests mechanosensitive activation of adhesion GPCRs》。CD97属于B类G蛋白偶联受体，参与肿瘤的分化、迁移、侵袭和转移过程，文章阐述了CD97及其配体CD55（衰老加速因子）介导免疫紊乱的病理过程。该文章借助X-ray、Biacore等技术平台揭示了GPCR CD97与CD55的结合模式及动力学参数，并结合突变实验验证了CD97分子中的D63、D81、E86、V137位氨基酸残基为介导其识别CD55的关键氨基酸，实验结果也与结构学信息相符。此研究内容为GPCR CD97与CD55的粘附力感应机制提供了理论基础。

图1 野生型/突变体CD97与CD55的动力学数据[1]

02. GPCR与皮肤松弛

2022年，Bayer公司等单位在《Frontiers in Pharmacology》发表文章《Expression and Characterization of Relaxin Family Peptide Receptor 1 Variants》。RXFP1（松弛素家族肽受体1）介导皮肤、肾脏、心脏、肺纤维化等生理过程，研究团队借助分子对接、F-SEC、Biacore等检测平台探究了RXFP1与relaxin（松弛素）的结合domain，为后续的小分子配体筛选、结构解析奠定了基础。从图2也可以看出，RXFP1的N端为介导relaxin识别的关键domain。

图2 RXFP1与relaxin的动力学表征（A图：RXF1的82-707 aa; B图：391-707aa，不含N端；）^[2]

03. 针对GPCR的小分子筛选

制备重组高密度脂蛋白（rHDL）颗粒，是针对GPCR非常常见的纯化、储存形式。2015年，Elena Segala等人在《FEBS Letters》发表文章《Biosensor-based affinities and binding kinetics of small molecule antagonists to the adenosine A_2A receptor reconstituted in HDL like particles》，围绕腺苷A_2A受体（与帕金森病相关的药靶蛋白）组装成的rHDL展开了小分子筛选工作。

研究人员探究了9个激动剂与腺苷A_2A受体的相互作用情况，比较DDM胶束与rHDL两种状态下的腺苷A_2A受体的表现差异。文章中采用NTA芯片，成功将DDM胶束或rHDL双分子层状态的腺苷A_2A受体稳定的偶联在芯片表面并展开了药筛工作。

关于rHDL与小分子配体的结合信息研究，这是首次在没有放射或荧光标记示踪分子的情况下，通过SPR在rHDL重组的GPCR上实现配体亲和力和结合动力学的测量。此外，研究团队借助Biacore验证了“rHDL重组形式+含去垢剂DDM”实验方案下的pK_D结果一致性，见图3，R²=0.9569。

图3 多个激动剂与不同形式的腺苷A2A受体的动力学表征与结果一致性分析^[3]

04. GPCR与单域抗体

2020年，安进生物制药等单位在《SCIENCE ADVANCES》上发表文章《Structure-guided discovery of a single-domain antibody agonist against human apelin receptor》，围绕APJ（人类脂肪细胞因子受体）展开了单域抗体激动剂的研发工作。研究人员找到了单域抗体激动剂JN241-9，并全面分析了JN241-9与APJ的结构特征及动力学表征数据，为A型GPCRs分子的抗体激动剂的研发提供了新思路。

实验中，采用NTA芯片捕获了带His标签的APJ（纳米盘形式），并借助单循环（Single-cycle）检测方式，快速拿到了高质量的检测数据。Single-cycle是非常高效的检测方式，省去解离时间、无需摸索再生条件，也可以用于实验的条件优化。

图4 单域抗体激动剂与APJ的动力学表征^[4]

05. GPCR与血液中Ga²⁺稳态

2021年，上海药物所等单位在《Elife》杂志上发表文章《Structural insights into the activation of human calcium-sensing receptor》，围绕CaSR（人钙感应受体）如何切换非活性状态、含有激动剂PAM状态展开了探究。CaSR能感受血液中细胞外Ca²⁺水平的微小变化，CaSR功能障碍或其基因突变会导致Ca²⁺稳态失调，患家族性低钙高血症、新生儿重度甲状旁腺功能亢进等病症。

研究人员借助Biacore设备筛选到多个抗体，能特异性结合非活性状态的CaSR，从而制备了抗原抗体复合物，并借助Cryo-EM解析CaSR的结构信息，为探究CaSR的感应机制提供了理论基础。实验中，直接将CaSR-ECD固定在CM5芯片上，纳米抗体作为流动相进行亲和力、动力学表征，最终筛选到NB-2D11制备对应的复合物。Biacore在得到亲和力（KD）的同时，也能计算出动力学参数（Ka/Kd），帮助我们筛选出高亲和、慢解离的互作分子。

图5 纳米抗体与非活性CaSR-ECD的动力学表征^[5]

06. GPCR与心血管疾病治疗

2021年，北京大学等单位在《Cell research》上发表文章《Cartilage oligomeric matrix protein is an endogenous β-arrestin-2-selective allosteric modulator of AT1 receptor counteracting vascular injury》，围绕血管紧张素II（AngII）受体1型（AT1）展开了内源性变构偏置调节器（文中的COMP）的机制研究。AT1在血管稳态及损伤中发挥作用，此内容为心脑血管疾病揭示了新治疗策略。

研究人员把AT1固定在CM5芯片上，COMP（血管细胞外基质蛋白）作为流动相进行检测。值得注意的是，HBS buffer中加入0.01% (w/v) DDM与0.002% (w/v) CHS，可用于维持GPCR分子的天然活性及构象，相关实验结果见图6。

图6 血管细胞外基质蛋白（COMP）/血管紧张素（Ang II）/凝血酶敏感蛋白（TSP-1）与AT1的动力学表征^[6]

07. 高通量配体筛选平台搭建

2019年，上海科技大学等单位在《Anal Chem》上发表文章《Accelerating the Throughput of Affinity Mass Spectrometry-Based Ligand Screening toward a G Protein-Coupled Receptor》，围绕A_2A腺苷受体（A_2AR）展开了基于亲和质谱的高通量配体筛选平台的搭建工作。A_2AR是一个很有吸引力的GPCR靶点，常用于免疫肿瘤、炎症和中枢神经系统疾病的研究。

课题组借助Biacore设备完成了15个潜在配体与A_2AR的识别-结合模式的进一步确证工作（单剂量实验与精确动力学表征），最终找到了高亲和识别A_2AR的配体3288。实验中，研究人员使用了Biacore控温功能，检测10℃条件下配体-受体的互作情况，同时也在实验体系中添加了0.1% (w/v) LMNG与0.02% (w/v) CHS。精确的控温效果与去垢剂兼容性，既保证了GPCR的活性，也满足了多元化的实验设计。

图7 针对A2AR的结合配体筛选及动力学表征数据^[7]

08. 重构脂质双分子层

如何在体外重塑并稳定GPCR的脂质双分子层结构并展开对应的药筛工作，一直都是备受瞩目的研究内容。2003年，犹他大学生物分子相互作用分析中心在《Analytical Biochemistry》上发表文章《Capture and reconstitution of G protein-coupled receptors on a biosensor surface》，以两个趋化因子受体（CXCR4与CCR5）作为模式系统，将构象抗体固定于L1芯片表面，从细胞裂解物中定向抓取GPCR蛋白，形成近天然状态的脂质双分子层，为优化GPCR的可溶条件筛选、分析GPCR特性等提供了新思路。

经验证，此实验方案具有（1）无需纯化受体蛋白；（2）受体均匀分布、朝向统一；（3）可达到高偶联水平，用于低分子量的配体检测工作。如图8所示，首先将1D4抗体固定在L1芯片表面，参考芯片指南（3.3 mM POPC +5 mM Chapso）构建脂质双分子层，然后定向捕获CXCR4。实验人员使用了多组构象敏感型抗体与CXCR4进行配对测试，结果均说明Biacore平台可被广泛用于研究膜相关受体。

图8 重构脂质双分子层实验流程及构象敏感型抗体的测试实验^[8]

通过今天的案例分享，我们可以看出Biacore在围绕GPCR展开理化性质表征时，具有得天独厚的优势：
1. 可提供动力学、亲和力参数：多维度解析研究内容，提供定性定量的实验数据；
2. 温控范围4-45℃（±0.003℃）：满足不同温度条件下的实验条件设计；
3. 兼容去垢剂：还原GPCR的脂质双分子层环境；
4. 芯片种类丰富：例如L1芯片，可直接在芯片表面构建脂质双分子层；
5. GPCR兼容性高：多聚体、纳米盘（nanodisc）、重组高密度脂蛋白（rHDL）等，多样的实验方案可供参考；
6. 支持单循环动力学：省事省力的完成实验，无需摸索再生条件、节省解离步骤；
GPCR作为跨膜蛋白家族中的翘楚，介导着众多至关重要的信号通路。随着对GPCR结构生物学、药理学和药靶结合模式更加深入的研究，大量新药靶点的发现，GPCR药物研发将继续新的征程。Biacore作为分子互作检测的“金标准”，在探究分子机制、药靶结合表征、抗体/小分子化药筛选等方面也有着非常丰富的成功案例。

参考文献：

[1] Structural basis for CD97 recognition of the decay-accelerating factor CD55 suggests mechanosensitive activation of adhesion GPCRs. 2021. Journal of Biological Chemistry.

[2] Expression and Characterization of Relaxin Family Peptide Receptor 1 Variants. 2022. Frontiers in Pharmacology.

[3] Biosensor-based affinities and binding kinetics of small molecule antagonists to the adenosine A2A receptor reconstituted in HDL like particles. 2015. FEBS Letters.

[4] Structure-guided discovery of a single-domain antibody agonist against human apelin receptor. SCIENCE ADVANCE. 2020

[5] Structural insights into the activation of human calcium-sensing receptor. Elife. 2021