码要绿，果要红！Biacore助您一探苹果变红的分子机制

两会期间，“树立大食物观”的观点被提出，水果是食物保障中的重要内容。中国的苹果年产量4406.6万吨（2020年），占全球苹果产量的近一半，常见的苹果品种也有几十种之多。超市里的苹果有红有绿还有黄，顾客关注哪个苹果好吃，而中国农业大学的研究团队则一直在盯着苹果果皮：它是怎么变色的？

苹果变红包括叶绿素降解（褪绿）和花青素积累。早在2018年，韩振海、吴婷老师团队发表在《Plant Physiology》的研究成果中，就发现乙烯响应因子ETHYLENE RESPONSE FACTOR17 (MdERF17)通过结合褪绿相关基因PPH、NYC的启动子来调控褪绿过程，其中Biacore提供了MdERF17与启动子结合的关键信息。近期文章中，作者首先利用免疫印迹法鉴定出与MdERF17相互作用的激酶MAP KINASE4（MdMPK4），利用Biacore T200，将MdMPK4固定在CM5芯片上，使MdERF17流过芯片表面检测动力学/亲和力，结果明确了MdMPK4-06G/14G与MdERF17-8s/3s的相互作用（图1）。

图1 Biacore检测MdMPK4与MdERF17的结合能力

随后作者利用免疫印迹和LC-MS发现MdMPK4-14G可以在Thr67位点磷酸化MdERF17-8s，而MdMPK4-06G则不能，这为后续昼夜调控的研究埋下了伏笔。沿着前文研究的信号通路，作者设计了以MdMPK4-14G和MdERF17为效应子，以PPH-LUC、NYC-LUC为报告基因来检测体内的互作，发现只有在MdERF17受MdMPK4-14G磷酸化后才会激活下游PPH、NYC的转录。

为了进一步研究这一机制对叶绿素降解的调节，作者比较转入了空载或MdERF17的苹果果实，发现转入MdERF17的果实中PPH、NYC表达水平升高，叶绿素含量降低，且这一现象仅在MdERF17能被磷酸化的一组中出现，说明MdERF17的磷酸化促进了叶绿素的降解。

研究团队之前的文章中利用Biacore发现ERF17基因重复编码区，丝氨酸残基增多，对下游叶绿素降解相关基因PPH、NYC启动子的结合能力和稳定性也随之增强（图2）。本文同样利用Biacore研究了不同长度丝氨酸的影响，在Biacore结果发现MdERF17-8S与MdMPK4的亲和力更强（表1）之后，作者选择了MdERF17-3S纯合子的紫塞明珠和MdERF17-6S/8S的红富士，发现果实成熟期间叶绿素降解与MdERF17磷酸化呈现正相关的关系，进一步说明MdERF17重复编码区中丝氨酸个数与其磷酸化和下游叶绿素降解的关系。

图2 Biacore检测发现ERF17中重复丝氨酸的数量影响与下游启动子的结合能力

表1 Biacore 测定MdERF17与MdMPK4的动力学参数

聊完了MdERF17，继续关注上游的激酶MdMPK4。前面提到，MdMPK4-14G可以磷酸化MdERF17，而MdMPK4-06G则不能。作者进一步比较MdMPK4-14G和MdMPK4-06G启动子上游的基因序列后，发现MdMPK4-14G独有一个昼夜节律相关的原件。由此团队研究了白天和夜晚时MdMPK4-14G的表达水平，蛋白丰度及MdERF17的磷酸化水平，发现MdMPK4-14G是个不折不扣的夜猫子！不仅在晚上表达水平高，蛋白丰度高，引起的MdERF17的磷酸化程度也更高。作者对嘎啦苹果过程成熟中进行持续暗处理，发现MdMPK4-14G直接参与黑暗条件下叶绿素的降解。

图3 黑暗条件下MdMPK4-14G的表达水平和磷酸化能力提高

至此，脉络逐渐清晰起来。基于大量的研究成果，作者提出了一个调控苹果变色的模型（图4）。晚上黑暗条件下，MdMPK4-14G带领着下游分子工作，降解叶绿素，给苹果褪绿，白天光照时，MdMPK4-14G休息，轮到MdMPK4-06G上场，积累花青素给苹果着红色。生物分子受光调节，同心协力，才结出了红的黄的绿的苹果，地球日过去不久，希望大家一直珍惜粮食呀！

图4 苹果果实中MdMPK4-14G介导的MdERF17磷酸化调控叶绿素降解

植物学的研究总是厚积薄发，并且关系着农业、食品、环境、药物等等，哪一个都与我们的生活息息相关。从生长发育机制到抗逆，从天然活性成分的发现到农残检测，Biacore一直全力支持着植物学研究者。劳动节刚刚过去，北方夏收即将到来，在这里祝农民朋友，科技工作者，参与粮食生产的每一位劳动者丰收！