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询价高通量药物筛选，有Ta不再复杂！
新药研发、老药新用等词汇经常出现在各大医药行业会议上，针对研发成本大、实验周期长等情况，如何从庞大的片段药物库、小分子化合物库中筛选出针对特定靶点的先导化合药（lead compound）呢？高通量药物筛选是一个非常值得关注的实验内容，小编这里整理了一份适用于片段药/化合药物筛选的操作指南。今天，就让小编带着大家来解读一下我眼里的高通量药物筛选吧！
表1 片段药物/小分子化合药的定义
如何从庞大的药物库里筛选出有潜力的先导化合物，我们可以按“Clean screen – Binding level screen – Affinity screen”三步法进行（具体内容见表2），即可对药物库的粗筛、精筛、亲和力表征等实验内容全部完成。
表2 高通量药物筛选三步法介绍
- 在粗筛环节，可通过Clean screen（单浓度进样，无需解离/再生/溶剂矫正等）将部分水溶性差、粘性较大的药物进行剔除（当待筛选药物总量不大时，此步骤可以酌情省略）；
- 随后经过Binding level screen（单浓度进样，观察进样段平台期的结合响应值），并结合各待测药物与阳性/阴性药物的响应值，设置合适的Cut-off数值，从而对待测药物进行结合水平的优先级排序；
- 接下来，可以使用Affinity screen（浓度梯度进样，进行亲和力/动力学表征）对Binding level screen中优先级排序靠前的待测药物进行测试，计算出对应的亲和力数值（KD）并进行再次排序，挑选出优质的先导化合药；
了解完“Clean screen – Binding level screen – Affinity screen”三步法后，现在让我们以一篇文章为例，进一步加深对高通量药物筛选的认识吧！
南开大学分子药物研究中心与澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室于2020年在杂志《Acta Pharmaceutica Sinica B》发表文章《20(S)-Protopanaxatriol promotes the binding of P53 and DNA to regulate the antitumor network via multiomic analysis》。该团队围绕在肿瘤发生、发展过程中起重要作用的肿瘤抑制因子P53，从精巧的单细胞组学视角（转录组学、蛋白组学、代谢组学等）探究了人参皂苷对肿瘤细胞的作用。同时，使用亲和质谱（Affinity MS）-表面等离子共振（SPR）联用的方式，对复杂的片段药物库（Fragment library）进行了高通量筛选与鉴定表征工作，最终证实了(S)-PPT为人参皂苷中的关键组分，能作用于P53-DNA结合口袋的附近区域，促进P53-DNA的相互作用，继而发挥抗肿瘤的药效。
文章思路如下：
图1.本文研究思路概览（详细内容见原文）
该课题组首先在人非小细胞肺癌细胞系A549上进行人参皂苷的给药测试，并展开了丰富的组学分析（转录组学、蛋白组学、代谢组学等）及多重信号网络分析（KEGG信号调理、PPI网络关系、GO富集分析等）。结果表明，从gene – miRNA – protein – metabolite的顺序逐一分析，P53为人参皂苷发挥抗肿瘤活性的关键蛋白。
图2.人参皂苷发挥抗肿瘤活性的宏观信号网络图
为确定人参皂苷中能与P53特异性作用从而发挥抗肿瘤效果的组分，该课题组使用亲和质谱与Biacore联用的方式开展了相关探究。经亲和质谱分析，该团队从人参皂苷的粗提物中，找到了潜在21个作用组分；随后，使用Biacore的Binding level screen实验模块开展了片段筛选实验（Fragment library screening），该团队从binding level (＞20 RU）、RSD (＜30%)、P (＜0.05)多个维度，筛选出15个潜在作用组分。随后，研究人员使用Biacore对其中5个高潜作用组分进行了Affinity screen。结果表明：这些高潜作用组分与P53的亲和力都要强于已知的稳定剂PhiKan083；其中，(S)-PPT与P53的亲和力最强。
图3.亲和质谱与Biacore对人参皂苷提取物进行高通量筛选
图4.P53与人参皂苷中5个高潜作用组分及阳性对照PhiKan083的亲和力表征数据
为进一步探究(S)-PPT与P53的作用方式，该团队通过分子对接实验，预测(S)-PPT分子结合于P53-DNA结合口袋的附近，并预估了介导(S)-PPT与P53的关键氨基酸位点。随后，该团队使用Biacore体外验证了野生型/突变体P53蛋白与(S)-PPT的互作情况，结果表明：V147、Y220、D228位点突变前后，(S)-PPT识别P53的能力大幅下降，即证明其为介导(S)-PPT发挥药效的关键作用位点。通过同源性分析，这三个位点在哺乳动物体内具有高度保守性。
图5.野生型或突变体P53与(S)-PPT分子的亲和力表征数据
文末，该团队使用Biacore与荧光共振技术联用的方式，进一步确认了(S)-PPT发挥抗肿瘤效果的作用方式。该团队使用Biacore，证实了P53与相关信号通路中上调基因(miR-760)、下调基因(miR-493-5p)均存在较强结合，证实了P53在相关信号通路中的重要性。此外，荧光共振的实验结果也表明(S)-PPT分子对P53-DNA的相互作用有促进效果。
图6.P53与上调/下调基因的亲和力表征数据
从复杂的人参皂苷中找到能发挥抗肿瘤效果的组分(S)-PPT，并探究出其作用机制，对于中药西药化的工作、或探究P53相关信号网络具有非常高的参考价值。同时，从比较复杂的样本（片段药物库、小分子化合物库等）中，如何高效快速地筛选到关键药物组分具有重大意义！
Biacore的高灵敏度、高分辨率、高通量等优点，确保了高通量药物筛选的实验效率与数据质量。与此同时，Biacore的超高样本兼容性、无分子量检测下限、支持有机溶剂矫正等优势，特别适合于分子量偏低、性质复杂的片段药/化合药物库！