效价测定知多少，SPR技术把你教 | 思拓凡学堂中国官网

每年季节更换之时，便是病毒性感冒、流感高发的时段。流感病毒容易发生突变或流行株改变，所以每年相关单位需要对预测毒株进行新流感疫苗的研发工作。然而，每批疫苗放行之前，都需要对其进行效价测定，才得以面世。

目前比较经典的用于检测流感疫苗效价的方法是SRID（单向免疫扩散法），SRID法虽然具有高特异性，但也存在劳动强度大、耗时、低通量、易受基质干扰、精密度/灵敏度低等缺陷。那么找到时效性强、准确度高、耐受性高的检测方法，对于流感疫苗的尽快面世，解决民生健康问题有极大帮助。美国默克与葛兰素史克围绕流感疫苗效价测定，展开了SPR技术与SRID的对比工作，数据表明SPR技术在检测流感疫苗的效价上极具优势（HA活性浓度测定时，R²=0.9815，P-value＜0.0001），极大缩减检测成本，实验数据结果也显示SPR技术与SRID检测值的一致性、相关性高。

接下来，让我们一起来看看具体实验设计及结果吧！

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实验设计：

芯片：CM5

实验步骤：捕获法（偶联proteinA/G；抓取抗体；流过含HA蛋白的测试品或标品）

方法模板：标曲法–浓度测定 (Concentration analysis)

缓冲液：HBS-EP+1% Zwittergent

再生液：50 mM NaOH

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实验结果：

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探究表面活性剂在实验体系中的必要性

在SRID效价测定实验中，一般会添加1% Zwittergent试剂用于降解HA抗原，进行结果测定。在SPR效价测定方案中，研究人员采用HBS-EP (±Zwittergent) 与PBS (±Zwittergent) 缓冲液测定了流感疫苗中HA的标曲，结果见图1。结果表明，当HA的浓度低于2 μg/mL时，缓冲液中添加1% Zwittergent可以增强结合响应值的灵敏度。所以，后续SPR效价测定方案中，均在缓冲液中添加了1% Zwittergent。

图1：流感疫苗中HA在不同缓冲液中的标准曲线

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探究流速在实验体系中的影响

研究团队通过设置不同的实验流速，对不同稀释比例的测试物进行了响应值观察，探究了实验流速对检测结果的影响，结果见表1。结果表明，测试物在SPR检测系统上不存在物质迁移效应，流速并不影响实验数据的采集，后续SPR效价测定方案中，实验流速为30 mL/min。

表1：流速对测试物与抗体结合的影响

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探究检测抗体的特异性

在效价测定实验中，抗体是一个至关重要的检测试剂。流感疫苗往往都是多价体系，所以在对其每个价型的效价测定时，需要用到特异性强、灵敏度高的检测抗体。研究团队在SPR检测平台上，测试了多个抗体与不同亚型或谱系的HA的反应特异性，结果见表2。结果表明，各个抗体在识别HA蛋白时，具有极强的灵敏度及特异性。

表2：抗体与不同亚型或谱系的HA的反应特异性

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单价或双价标准抗原的结合特性对比

由于检测抗体均具有极高的特异性，所以在获取HA标准抗原的标准曲线时，可以考虑使用混合多价抗原替代单价抗原。研究团队准备了单价抗原和多价抗原的混合液、三批单价疫苗原料药、三批四价疫苗药品，和针对B-V病毒株的特异性抗体，进行HA蛋白定量测试，结果见图2。结果表明，标准抗原以单价或者多价混合液形式进行测试物的效价测试时，并无明显差异。

图2：单价或双价标准抗原对效价测定的影响

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不同类型的标准抗原对效价测定的影响

研究团队围绕标准抗原的来源展开了探讨，探明了不同类型的标准抗原（完整病毒颗粒、裂解后抗原、亚单位抗原）在使用SRID或SPR技术进行效价测定时，都没有明显差别，结果见图3与图4。

图3：不同类型的标准抗原对效价测定的影响

图4：不同抗原形式搭配SRID与SPR技术进行效价测定

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SPR与SRID效价测定法的相关性

研究团队为探究SPR与SRID效价测定法的相关性，围绕22批疫苗原料药及四价疫苗药品（覆盖H1、H3、B-Y和B-V四个病毒株）进行了效价测定，浓度范围为40-800 μg/mL，结果见图5。观察图5A，经线性回归方程对SPR于SRID效价测定的结果进行分析，发现R2为0.9815，P-value＜0.0001。为探究两种效价测定技术的结果一致性，研究团队使用Bland-Altman测试进行数据分析，得知标准差SD为8.273，95%置信区间为-13.48~18.95。所以，SPR技术与SRID的检测结果有强相关性。

图5：SRID与SPR检测方法的结果相关性分析

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SPR技术对流感疫苗中间体效价测定的可行性

为评价是否可以使用SPR技术对流感疫苗生产周期中的中间体进行效价测定，研究团队准备了多个生产阶段的中间体，覆盖了表达上清到纯化后的纯品四个阶段。使用SPR和SRID对不同阶段中间体进行效价测定，结果见图6。结果表明，SPR技术进行效价测定时，其准确度并不会随疫苗中的杂质干扰，并且SPR与SRID技术的结果相关性并不会在疫苗纯化制备环节中发生巨大改变。

图6：使用SPR和SRID技术对流感疫苗不同生产阶段进行效价测定

流感疫苗具有独特性，需要每年进行新的研制、报批放行工作。所以，为加速流感疫苗的供给，一种数据稳定、高通量、对试剂或测试品耐受性好的新兴技术是极具优势的。使用SPR技术对流感疫苗进行效价测试时，其LOD和LOQ分别为5 ng/mL和40 ng/mL，比SRID的灵敏度高出150多倍（SRID检测法的LOD为6 μg/mL）。研究团队经过多轮实验数据对比及分析，确实了SPR技术在以流感疫苗为例的效价测定类实验中的可行性及适应性，也高度认可了SPR技术相较传统SRID或ELISA技术的别样优势—高通量、高灵敏度、高效率。

SPR技术采用全持续流检测技术，既可以避免物质迁移效应对实验的影响，也能耐受各类纯品或混合样品进行效价测定。常规的杂交瘤上清、细胞裂解上清、表达体系上清中特定蛋白组分的定量等工作，都能出色完成，加速您的实验成果发现。