生物芯片传感技术如何助力搭建高质量核酸筛选平台

高通量基因文库的筛选平台搭建已被广泛用于转录调控上下游相关基因寻找、药物靶点/核酸适配体筛选、基因疗法等研究领域。值得注意的是，生物芯片传感技术以其无需标记、可再生、多通道等优势为核酸筛选提供了一条无酶、免扩增的新路子。接下来，就让小编带着大家一览生物传感芯片如何助力高质量核酸筛选平台搭建吧！

2021年3月，中国农业科学院生物技术研究所基因安全评价与应用团队借助Biacore T200，开发了针对核酸靶标的多重、可再生的生物传感技术，为转基因检测提供新的高效手段，相关文章《A multiplex and regenerable surface plasmon resonance (MR-SPR) biosensor for DNA detection of genetically modified organisms》也发表在分析化学经典期刊《Talanta》上。

图1 实验步骤概览（A. 实验流程图及生物学意义；B. 芯片表面修饰示意图）^[1]

T-nos、CaMV35S、cry1A为转基因植物的关键元件，实验人员分别制备了带生物素标记的仅含保守序列的单链核酸探针，并命名为CaMV35S probe、T-nos probe、cry1A probe。如图1B所示，芯片1通道作为参比通道，CaMV35S probe、T-nos probe、cry1A probe分别偶联在2、3、4通道。若待测物流经芯片表面时，与CaMV35S probe、T-nos probe有信号响应，即证明待测物中含有转基因组分。研究人员利用T200的四个通道，一次进样即可对三个目标基因进行检测，真正实现了多重检测的目的。

图2 筛选探针最适长度及特异性测试（A-G，探针长度分别为35, 25, 20, 15, 10和5 nt；Mix A、Mix B与Mix C为不同核酸的混合物，三者互为对照。）^[1]

实验团队进一步对使用的探针长度进行了优化，将不同长度的探针（5-35 nt）固定在芯片表面，如图2（左）所示，随着探针长度的增加，得到的响应信号逐步升高。研究人员发现，当使用的探针长度增加到35 nt时，信号值反而降低了，因此最终选择25 nt作为最佳的探针长度。

为验证这一新型转基因检测技术的特异性（Specificity），研究团队制备了一系列核酸混合物，其中Mix A为T-nos与其他阴性对照基因的混合物，Mix B为CaMV35S 基因与阴性对照基因的混合物，Mix C为cry1A基因与阴性对照基因的混合物，从检测结果可以看出（图2右），固定了不同检测探针的通道可以高特异性地识别相对应的检测基因。

在对方法的灵敏度（Sensitivity）进行确认的时候，研究人员测试了在不同偶联水平下灵敏度的差异，最终确认探针最佳偶联水平为1000 RU（整体响应信号最佳），此时的检测限LOD为0.1 nM（图3）。

图3 灵敏度测试^[1]

有效的再生对数据分析至关重要，在保证重复性的同时可以增加传感芯片的使用次数，实验团队采用50 mM NaOH作为再生条件，通过图4 E-F，不难看出此方法的重复性非常理想，至少可重复使用100次 （连续监测20天）。

为了验证传感芯片多重检测的性能，实验团队制备了四种不同的样本。如图4 A-D所示，基于Biacore设计的新型转基因检测技术能敏锐检测出不同样本之间的差异，并且无需其他辅助的信号放大手段即可对检测结果进行表征。

图4 特异性及稳定性测试（A: 样品A包含 T-nos, CaMV35S, cry1A；B: 样品B包含T-nos, CaMV35S；C: 样品C包含T-nos, cry1A；D: 样品D包含CaMV35S, cry1A；E: 使用50 mM NaOH,连续6次进样-再生步骤的实验图谱；F: 20天内不间断使用50 mM NaOH,连续100次进样-再生步骤的实验图谱）^[1]

^{准确、灵敏且快速的分子诊断技术是生物安全检测的基础，生物传感技术为此提供了新的方向与应用策略。研究人员采用Biacore检测技术，巧妙地设计了多通道、多靶标的分析方法。当不同靶标样品流经芯片，不同通道可以实时输出对应分析物的信号，从而实现多重检测。该策略可实现同时对转基因元件CaMV35s启动子、nos终止子以及cry1A基因的定性和定量分析，并且检测的准确度和精度相较传统方法有大幅提高。通过优化条件，该传感技术对于以上三种靶标的LOD可以达到0.1 nM。该方法不仅可以对转基因实现快速筛查，制成的芯片可在20天内至少再生使用100次，并且保持较高的检测性能。} 

核酸适配体（单链DNA或RNA）因为其高亲和力、易于制备、可精确定点修饰等特点，被广泛应用于疾病诊断、递送元件筛选、治疗药物开发等领域，一般通过体外指数富集配基系统进化（SELEX）技术筛选得到。筛选出核酸适配体后，会进行序列剪裁、优化、修饰等环节，又称为post-SELEX，此环节一直以来是证实适配体有效性的前提和关键难点。

军事医学科学院毒物药物研究所的郭磊老师课题组，通过创建小型多方向步进型适配体组合文库，借助Biacore T100全面、高效地完成适配体序列的剪裁、优化，为post-SELEX提供了有效的创新思路，并于2017年5月在期刊《Analytical Chemistry》上发表文章《Stepping Library-Based Post-SELEX Strategy Approaching to the Minimized Aptamer in SPR》。

图5 文章实验框架概览^[2]

研究团队提出 “序列中相邻碱基位点极可能通过碱基堆积及氢键作用影响空间相互作用”的新颖观点，以重组人促红细胞生成素α（EPO-α）的适配体807-39 nt为模式分子，创建小型多方向步进型适配体组合文库，并开发了实时、无标记的SPR筛选法，从35条序列中高效地筛选到最短适配体In27，相关筛选思路见图5。

2021年8月，北京大学、北大-清华生命科学联合中心魏文胜老师课题组、肖俊宇老师课题组与中国医学科学院/北京协和医学院王健伟老师课题组围绕SARS-CoV-2入侵细胞的新受体研究，联合展开了高通量筛选工作，并在期刊《Science China Life Sciences》上发表文章《Genome-wide CRISPR activation screen identifies candidate receptors for SARS-CoV-2 entry》。在此研究中，实验人员基于CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）系统与Biacore、Real-time qPCR等技术，发现了多个介导SARS-CoV-2入侵宿主细胞的新受体。

图6 全基因组CRISPRa功能性筛选流程^[3]

^{结合SARS-CoV-2中和实验、Biacore等实验结果，研究发现有3种组织特异性高表达的膜蛋白LDLRAD3、TMEM30A和C}

^{LEC4G可以不依赖于ACE2的方式介导病毒入胞。如图7所示，LDLRAD3、CLEC4G与S蛋白的亲和力KD分别为293 nM和282 nM，与ACE2差异不大。经分析，LDLRAD3在神经元中高度表达，CLEC4G在肝脏、淋巴结和单核细胞中高度表达，跨膜蛋白TMEM30A在基因敲除实验中也证实了与SARS-CoV-2入胞的重要性。上述三种极具组织特异性或广谱表达的受体分子的发现，对解释SARS-CoV-2的多器官嗜性、多入侵机制提供了新思路。}

图7 SARS-CoV-2 S蛋白与受体ACE2、LDLRAD3、CLEC4G的动力学表征^[3]