Biacore助力PROTAC解析三元复合物

蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis targeting chimeras，PROTAC）是一种靶向诱导蛋白降解的新兴技术，最早于2001年由耶鲁大学Craig Crews教授团队所提出。PROTAC利用机体内天然的泛素蛋白酶系统 （UPS） 实现目标蛋白 （POI） 的靶向降解，达到治疗疾病的目的。

PROTAC是一种具有双功能的分子，由靶蛋白配体以及E3泛素化连接酶配体通过合适的连接体所组成，其中一个配体能够与靶蛋白结合，另一个配体则用来招募 E3 连接酶（E3 ligase)， 形成三元复合物。E3泛素连接酶得以靠近靶蛋白并将多个泛素（Ubiquitin）传递到靶蛋白形成标记，带有泛素标记的靶蛋白被细胞本身的蛋白酶体（Proteasome）系统识别后，便会降解为众多小片段肽（图1)。PROTAC利用细胞内天然存在的泛素-蛋白酶体来降解靶蛋白，具有药量低、毒性低、作用持续时间长、副作用少等多种优势，近几年已被积极应用于癌症、神经退行性疾病、免疫调节疾病等治疗药物的开发，为疾病的治疗提供新的策略。

相较于传统药物， PROTAC具有多个显著优势：

1. 传统药物的作用模式需要占据靶点的活性位点，阻断下游信号通路从而破坏靶蛋白的功能。而PROTAC可以结合靶蛋白表面的任何位点介导其降解，可靶向“不可成药”的靶点。
2. PROTAC 分子不会与靶蛋白一起降解，在细胞里可以循环再利用，形成催化性的运作机制，促使下一个目标蛋白降解，使得PROTAC分子在较低浓度就能实现多个目标蛋白降解，可以在较低剂量达成疗效，并解决抗药性的问题。
3. PROTAC形成三元复合物时具有正协同效应，该复合体的亲和力高于PROTAC单独与靶蛋白的亲和力。

图1 PROTAC机制示意图 (来自Baylor College of Medicine – pharmacology and chemical biology以及molecular and cellular biology的Dr.Jin Wang教授的团队)

近年来出现很多用于分析三元复合物形成机制的实验方法，每种方法都有自身的优点和局限性。例如这些方法都需要对样品进行标记，并且无法得到准确的定量数据。2019年英国邓迪大学Alessio Ciulli教授所带领的团队在ACS Chemical Biology 发表题为SPR-Measured Dissociation Kinetics of PROTAC Ternary Complexes Influence Target Degradation Rate的研究论文，使用Biacore建立了一种新的方法来检测 PROTAC 三元复合物的动力学，并阐明动力学数据是衡量靶标有效降解的重要参数。

PROTAC MZ1 是由E3连接酶配体VH032与JQ1通过linker连接形成，JQ1是BET溴结构域抑制剂。BET蛋白家族是Bromodomain 蛋白超家族的一个亚类，N端包含两个保守的溴结构域BD1和BD2（图2）。已知JQ1与BET家族成员Brd2，Brd3，Brd4的任一溴结构域（BD1和BD2）均能够结合，并未展示明显的选择性，然而形成的MZ1却表现出对Brd2和Brd4更快的降解效率。为了全面地了解Ligase : PROTAC : POI的亲和力动力学详细表征，研究团队在Biacore上设计实验，分别对于PROTAC与E3连接酶VHL结合形成二元复合物（Binary）以及POI：PROTAC预先孵育再与VHL结合形成三元复合物（Ternary）进行动力学与亲和力的检测。

图2 BET蛋白家族成员Brd2，Brd3，Brd4，实验中使用单个溴结构域（BD1或BD2）

如图3所示，研究人员将带有生物素标签的E3连接酶VHL固定在SA芯片上，将PROTAC作为分析物检测两者形成二元复合物的亲和力和动力学（图3左）。然后再将PROTAC与靶蛋白Brd4^BD2孵育后进样，得到了三元复合物的动力学数据（图3右）。

图3  PROTAC MZ1 形成二元与三元复合物实验示意图

实验结果显示Binary亲和力为29nM，t_1/2=43s；Ternary 亲和力为1nM，t_1/2=130s；研究人员引入协同因子（cooperativity， α）的概念直观地表征三元复合物之间的协同性（图4），PROTAC MZ1与Brd4^BD2的协同因子（α）为22，具有正协同效应，这种高度协同复合物的 PROTAC 比其单独的组成有更高的亲和力和稳定性，具有更高的泛素化水平，能够更快地降解靶蛋白。

图4  描述PROTAC 二元和三元复合物之间的协同性(cooperativity， α)

接着，研究人员们使用同样的实验方法测定了PROTAC MZ1与三种 BET 蛋白 Brd2、Brd3 和 Brd4不同溴结构域 BD1 或BD2 ，以及VCB (biotin−VHL) 形成三元复合物的协同性和动力学（图5）。结果显示，在所有BD1 结构域存在的情况下， MZ1 与VCB 解离较快，而在BD2 结构域存在时都表现出较慢的解离，复合物有较高稳定性。显示PTOTAC MZ1主要是由BD2所形成的复合物来驱动降解，此结果与生物物理方法和文献数据一致。

根据Biacore得到的亲和力和动力学数据计算复合物的协同因子α与t_1/2数据。MZ1与BD1的协同性（α = 2.0 – 3.6）低于BD2的协同性（α = 3.9 – 48），并且Brd2^BD2 和 Brd4^BD2 三元复合物的 t_1/2（400 和 220 秒）比Brd3^BD2（40 秒）更长，证明MZ1 与 Brd2^BD2 和 Brd4^BD2形成更稳定的三元复合物，这也解释了为什么MZ1表现出对Brd2和Brd3更快的降解效率。

图5 Biacore 结果显示不同 VCB:MZ1:BD 复合物的动力学结果有显著差异

在PROTAC研究中，形成高度稳定的三元复合物对 PROTACs 的作用方式至关重要。Biacore能够提供包括亲和力和动力学在内的精准定量数据，并计算得到复合物的协同因子α以及t_1/2数值，预测PROTAC降解靶标的速率和活性，为PROTAC药物研发提供关键性数据。

图6 文章整体思路梳理

Biacore在整个PROTAC研究中体现了强大的优势：

1. 在PROTAC三元复合物的检测中，Biacore特有的管路进样的设计和连续进样的模式（dual injection），能够实现样品连续无缝进样，获得可靠全面的数据。
2. 在一个通道上即可完成二元复合物和三元复合物的检测，通过放置96/384孔板实现无人值守检测，兼顾高通量实验的需求。
3. 高灵敏度保证了可以在低偶联量的条件下完成互作检测，避免物质迁移效应（Mass transport）对实验的干扰，得到精准且可重复的数据。
4. 高亲和力的 PROTAC ，通常半衰期极长，单循环动力学 (SCK)可以显著减少实验时间，Biacore极佳的基线稳定性也保证了高亲和样品的准确检测。
5. 智能的数据分析：通过Rmax 可以直接判断是否形成二元或三元复合物(形成的三元复合物的 Rmax 可能大于二元复合物的 Rmax 的 10 倍，具体取决于 PROTAC 和目标的大小)。实验得到的亲和力和动力学数据（ka， kd和KD）能够计算得到t_1/2=ln2/ kd与协同因子 (α= KD_binary/KD_ternary)，直观预测PROTAC的作用方式。