Biacore助力选择性IKZF2“分子胶水”的发现和表征

蛋白降解剂主要有以下两类

• 一类是PROTAC，通过泛素-蛋白酶体途径降解靶蛋白。
• 另一类是分子胶水，也是通过结合泛素化连接酶，但与PROTAC不同的是，分子胶水是通过诱导泛素连接酶和底物之间的PPI进而导致蛋白降解，能够降解不可成药靶蛋白，不需要在靶蛋白上有结合袋。

图1：分子胶和PROTAC比较

由于分子胶具备更良好的类药物特性，目前已有一些抑制剂处于临床研究中，但分子胶的研究仍处于起步阶段，大多数分子胶降解剂都是偶然发现的，分子胶要合理地发展成治疗剂还有很长的路要走。今天小编给大家介绍一篇诺华发表在Cell Chemical Biology的文献，该文报告了一种IKZF2的选择性分子胶降解剂 (NVP-DKY709) 。该策略通过调节泛素连接酶E3底物衔接子的构象使得IKZF2被泛素特异性修饰，降解IKZF2，同时保留 IKZF1/3。

恶性肿瘤可以通过诱捕免疫抑制调节性T细胞 (Treg) 来逃避免疫系统的攻击。转录因子IKZF2在Treg细胞核一些T细胞和淋巴细胞亚群中表达，研究表明，IKZF2在Treg细胞和其他T细胞中的降解会增强抗肿瘤免疫反应，这使IKZF2成为癌症免疫治疗的中的一个靶点。通过CRBN E3连接酶介导的IKZF1/3降解剂已成功开发，但也会引起血细胞毒性，因此作者研究和创制了IKZF2的选择性降解剂。

NVP-DKY709的确定

泊马度胺 (pomalidomide) 可以有效的降解IKZF1，也会引起少量的IKZF2与CRBN的连接，因此作者选择它作为母本进行改造。结构上看，泊马度胺与CRBN连接体结合在IKZF1锌指2中的甘氨酸β发夹，而同样区域的IKZF2与1 (H141-Q146) 只有一个氨基酸的差异，为验证这一差异的影响，作者用泊马度胺降解IKZF2 (H141Q) 突变体，与IKZF1对比发现两者降解程度十分相似。初步设计证明，泊马度胺-5取代能减少对IKZF1的连接，因此作者依此设计了5种泊马度胺-5取代的小分子并进行选择性验证。其中5 (NVP-DKY709) 显示出良好的CRBN连接能力和IKZF2选择性降解能力。

最小作用基序 ZF2-3

图2：(A, B) DKY709与DDB1:CRBN复合物结合的SPR分析，KD为18±6 nM (N=2) 。

在5 mM DKY709存在下，使用Biacore表面等离子共振 (SPR) 技术，固定DDB1：CRBN检测DDB1：CRBN：DKY709复合物亲和力为KD 18 nM，（图2），远高于DKY709对CRBN的亲和力。为了更深入地理解这种相互作用，作者分开合成了转录因子的不同锌指结构，并利用Biacore测定了蛋白间的二元或三元相互作用。含有cxxcg的ZF2、ZF2-3和ZF1-4的IKZF2截断蛋白与DDB1：DKY709复合物的亲和力分别为4.2±1.6 mM、0.19±0.01 mM和0.56±0.06 mM（图3A）。ZF2可单独与DDB1：CRBN：DKY709结合，ZF2-3与DDB1：CRBN：DKY709结合具有22倍的亲和力，这表明ZF3也有助于结合。ZF2-3和较长的ZF1-4的结合强度相似，表明ZF2-3是IKZF2在DKY709存在时与CRBN相互作用的最小结合成分。作者又用Biacore进行了IKZF2在DKY709存在的情况下与CRBN相互作用的检测。图4显示了存在DKY709相对于不存在的对照组下ZF2结合明显提升，这一结果很好的证明了复合物的协同性。随后作者使用X-ray分析了不同复合体的结构和作用力。

图3：含有cxxcg的ZF2、ZF2-3和ZF1-4的IKZF2截断蛋白与DDB1：DKY709复合物的亲和力检测

图4：在5 μM DKY709（黑色）存在下将IKZF2 (ZF2) 与固定化的DDB1：CRBN结合的SPR数据，及在没有DKY709（仅DMSO，红色）的情况下检测数据。

接着，研究了DKY709对原代人Treg细胞表型和体外功能的影响，结果显示该化合物在Treg细胞中对IKZF2强大的降解能力（降解90%），DKY709在小鼠和猴子中表现出良好的药代动力学特性，吸收快，生物利用度好，在人，非人灵长类动物和兔细胞中均实现了IKZF2高效降解。

综上，作者对泊马度胺进行改造，开发出了特异性IKZF2降解剂，分析了IKZF2降解对Treg细胞的影响，并验证了其在癌症免疫治疗中的作用。该工作发现新的转录因子CRBN结合小分子降解剂DKY709，该化合物目前已经进入一期临床试验。

靶向蛋白质降解正在成为新药发现和开发中一种很有前景的方法。分子胶避开了传统抑制剂的局限性，使得一部分靶点从“无成药性”变为“有成药性”。分子胶作为类药物小分子蛋白质降解剂具有内在优势。例如较低的分子量、较高的细胞渗透性和更好的口服吸收。因此，分子胶为靶向蛋白质降解的创新药物发现提供了一种替代方法。Biacore特有的管路进样的设计和连续进样的模式 (ABA) ，能够为实验创造较小的液体环境，为协同效应的证明获得可靠全面的数据。Dual Injection与Poly injection在一个通道上即可完成二元复合物和三元复合物的检测。

图5：Biacore多种创新进样模式

通过放置96/384孔板实现无人值守检测，兼顾高通量实验的需求。高灵敏度保证了可以在很低的分子量下完成互作检测，得到精准且可重复的数据。Biacore良好的基线稳定性也保证了高亲和或低亲和样品的准确检测。高通量、高灵敏的Biacore能够更好的为分子胶降解剂的筛选与发现保驾护航。