Biacore检测蛋白与核酸相互作用的常见问题 — 从核酸适配体说起

在本文中，智荟专线将以蛋白与核酸互作研究中的一个小的领域——核酸适配体作为切入点，通过文献分享简单探讨一下小伙伴们可能关心的一些常见问题。

适配体（aptamer）根据分子类型一般可以分为两种：核酸适配体和多肽适配体；其中核酸适配体又可以分为DNA和RNA适配体^[1]。核酸适配体一般是由一条寡核苷酸链折叠形成特定的构象，对于特定的靶标分子（蛋白、多肽、寡糖、寡核苷酸等）具有较高的特异性与亲和力^[2]。核酸适配体的制备过程一般是基于SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）技术，从化学合成的随机序列核酸文库中，利用靶标分子特异性富集互作的寡核苷酸，并通过多轮循环得到特异性结合的核酸适配体^[3]。后续可以通过质谱检测确定其组成，或者通过Biacore检测具体的亲和力。

同样对于靶标分子具有较高的特异性，核酸适配体相比于常规抗体表现出的优势有：靶标分子种类更丰富且亲和力相对更高；分子量较小，具有较低的免疫原性；合成与修饰相对简便^[4]；化学稳定性更高等。这些优势也使核酸适配体在体外诊断、药物递送载体等领域获得了一定的关注。

文献一：检测针对丙肝病毒（HCV）NS3蛋白酶结构域（ΔNS3）的RNA适配体（及其突变体）与相应靶标蛋白的亲和力参数^[2]

作者选用CM5芯片先偶联anti-His的抗体，再捕获靶标蛋白，检测与RNA适配体及其突变体的相互作用（如下图1所示）。检测实验在Biacore 2000系统上进行，检测温度为25℃；使用的运行缓冲液成分为50 mM Tris-HCl pH 7.8，60 mM NaCl，5 mM CaCl₂，0.005% surfactant P20。使用CM5芯片检测的具体实验操作方法如下：

1. 50 μg/mL的anti-His抗体在pH 5.0的醋酸钠条件下偶联到CM5芯片上。
2. 浓度2 μM带有His标签的靶标蛋白被固定至这张自制的捕获芯片上，捕获时间30 min，流速2 μL/min。
3. RNA适配体以及不同的变体分别进样检测，浓度范围为50 – 800 nM；进样和解离时间均为180 s。
4. 再生缓冲液条件为50 mM Tris-HCl pH 7.8，1 M NaCl，0.005% surfactant P20，每个循环再生过程运行5次，每次15 μL。

图1. 使用CM5芯片偶联anti-His抗体，捕获带有His标签的ΔNS3蛋白，检测与RNA适配体的结合。左图为配体固定方法与检测过程示意图；右图为响应值图谱，其中R161A为ΔNS3蛋白的突变体，捕获量与野生型基本一致。^[2]

通过上述操作方法，作者检测了不同的RNA适配体与ΔNS3蛋白的亲和力，其中ΔNEO-Ⅲ-14U这一种适配体的变体与靶标蛋白之间的亲和力最高，KD ≈ 40.2 nM；这可能是其末端14个尿苷（14U）形成的单链尾部促进了与蛋白的结合（如图2所示）。

图2. RNA适配体ΔNEO-Ⅲ-14U与ΔNS3蛋白结合的Biacore分析响应值图谱，与适配体的二级结构示意图。其中右图上的空心字体区域表示的是不同适配体可变的随机序列部位。^[2]

文献二：筛选针对小鼠GP2蛋白的RNA适配体，检测两者的亲和力，并确定适配体上对结合起关键作用的序列^[4]

小鼠的GP2（Glycoprotein 2）特异性表达在肠道M细胞（Microfold cells）中，在引发抗原特异性的免疫反应过程中起到受体作用，因此被确定为适配体筛选的靶标蛋白。实验过程大致如下：

1. 通过上面提到的SELEX技术，筛选得到RNA适配体（候选序列）。
2. 利用Biacore检测适配体与靶标蛋白之间的亲和力。使用的系统为Biacore 3000，运行缓冲液为PBS；浓度25 nM的生物素化的适配体样品流经SA芯片表面被固定，分析物小鼠mGP2-Fc蛋白的浓度范围在0 – 1000 nM；结合与解离时间均为240 s。
3. 通过对适配体上loop区域序列的突变，验证其对蛋白-核酸结合的重要性。通过SELEX实验，作者筛选得到了十一条不同序列的适配体，其中Apt 1的丰度约60%，因此后续针对该适配体，通过Biacore检测了其与靶标蛋白的亲和力，KD ≈ 110 nM（如下图3所示）。

   
   图3. 适配体Apt 1与mGP2蛋白结合的Biacore实验响应值图谱。曲线上方标注的是对应的蛋白分析物浓度^[4]。

以上两篇文章均使用Biacore系统，尽管采用的芯片以及固定策略不同，但均通过多循环动力学分析拟合得出了结合反应的平衡解离常数，定量分析了核酸适配体与蛋白的相互作用。

01. 我应该固定蛋白还是核酸？如何固定？

• 样品性质：如果蛋白样品不纯，可以考虑通过捕获法来固定蛋白。
• 实验目的：如果核酸分子已确定，需要测试不同种类的蛋白与其的亲和力，此时可能先考虑固定核酸；反之亦然。

至于配体固定方法，蛋白类样品可以考虑直接偶联或者捕获法，而核酸分子一般是通过生物素修饰后用SA/NA系列芯片进行固定。核酸分子一般携带大量的负电荷，不一定能顺利实现预富集；另外，核酸分子上的伯氨基位于碱基上，如果反应后可能会影响结合活性、影响双链互补或者形成高级结构。因此，一般不考虑通过直接偶联法来固定核酸。

02. 检测核酸分子的长度/大小有没有限制？

理论上对于核酸样品的大小没有严格的限制，但是我们一般建议将核酸链长控制在300 bp/nt以内。对于过长的核酸分子，蛋白在上面可能有多个不同的结合位点，实验结果可能无法用已有模型进行拟合。因此在一般情况下，我们建议使用相对短一些的核酸片段（即参与结合的核心区域）来进行互作研究。

03. 核酸样品需要进行什么处理？