助力粮食增产 — Biacore助力玉米Zmcen蛋白与下游靶肽作用机制研究

玉米（Zea mays L.）是我国种植面积最大、总产最高的农作物，对我国粮食安全有着重要影响，因此对玉米中关键性蛋白的深入研究对粮食增产和粮食安全至关重要。2021年11月，长治学院化学系雷海英老师研究团队在SCI期刊RSC Advances上发表了题为Study on the interaction of Zea mays L. centrin and melittin的研究论文，报道了玉米中心蛋白Zmcen与下游靶肽melittin的作用机制，这为进一步阐明Zmcen在细胞分裂、细胞运动等重要生命过程中的作用机制提供了理论依据。

中心体蛋白(Centrin)是一类高度保守的钙结合蛋白，也称为Caltractin，是EF-hand超家族中钙调素（Calmodulin, CaM）的成员之一，广泛存在于原核生物、真菌、植物和动物中。Centrin能结合不同大小、结构的多肽，并以多种方式调控其活性，从而调节细胞的生命活动。有研究表明，Centrin是微管组织中心（microtubule organizing center，MTOC）的组成部分，存在于MTOC的不同部位。Centrin在细胞分裂过程中主要发挥两种功能，其中之一是MTOC的复制；另一种功能是会随着Ca²⁺浓度的变化而变化，从而调节MTOC的运动。目前高等植物中心蛋白的报道较少，而玉米中心蛋白的功能研究尚属空白。

在这篇文章中，研究人员使用圆二色谱和荧光光谱解析了玉米中心蛋白Zmcen与下游靶肽melittin结合前后的二级结构变化。发现Zmcen与melittin结合后α螺旋的含量明显增加，而且随着melittin浓度的增加，在222 nm和208 nm处的峰值基本没有变化，说明Zmcen与melittin的结合比例为1:1。

随后作者利用荧光光谱进一步探究了在Ca²⁺/TNS存在的情况下对Zmcen与melittin结合的影响。结果表明在Ca²⁺存在时，Zmcen与melittin也是1:1结合，且荧光强度明显大于Ca²⁺不存在时的结合荧光。推测这可能是由于Ca²⁺与蛋白质结合后，蛋白质的构象发生了变化，从而暴露出大量的疏水区域。而当TNS存在时，Zmcen和melittin也有结合。但当Zmcen与melittin的结合比达到1.0时，峰值强度下降，说明TNS的存在减弱了Zmcen与melittin的结合。

最后研究人员采用荧光光谱和Biacore检测技术探究Zmcen和melittin的结合区域。荧光光谱结果显示，Zmcen的C端截短蛋白（C-Zmcen）和melittin以1:1的比例结合，而N端截短蛋白（N-Zmcen）与melittin的结合较弱，没有明显的相互作用（如图1所示）。

图1. 荧光光谱检测melittin与C-Zmcen和N-Zmcen结合

随后作者又利用Biacore对上述结果进行了验证。研究人员使用CM5芯片偶联melittin蛋白（10mM acetate buffer, pH 5.0），然后将Zmcen（125, 250, 500, 750, 1000 nM）, C-Zmcen（250, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 nM）, N-Zmcen（250, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 nM）按照浓度梯度进样（30 μL/min, 120s）流过芯片表面。结果显示，melittin与全长的Zmcen蛋白的亲和力为2.0665×10^-6 M^-1（图2A），与C-Zmcen的亲和力为2.8958×10^-6 M^-1（图2B），而与N-Zmcen无结合（图2C）。此外，作为阴性对照的BSA蛋白与melittin蛋白相互作用的数据如图2D所示。即使当BSA浓度为2000 nM时，也不会与melittin发生相互作用。Biacore的数据与荧光光谱的结论一致，说明melittin在Zmcen上的结合位点主要在Zmcen的C端。

图2.  Biacore检测Zmcen与melittin结合的传感图

图3. 文章整体思路

回顾文章整体思路，作者通过Biacore在分子水平上直观地证实了Zmcen可与下游靶肽melittin相互作用，且主要的结合部位在Zmcen的C端。研究人员在文章中明确指出，SPR技术可以实时动态监测整个反应过程的信号变化，在分析过程中无需对样品进行标记，所需要的样品量极少，并且提供了传统技术难以获得的大量生物分子相互作用信息。本文的研究不仅解析了玉米中Zmcen与melittin的作用机制，而且填补了在高等植物中有关Zmcen蛋白的研究空白。

自1990年上市至今，Biacore作为分子互作检测的“金标准”，成功助力基础科研与药物开发等多个研究领域取得重大突破，累积发表的文献量已超五万篇，超过 80% 的已上市的抗体药物的研发、申报、生产过程中也均有 Biacore 的身影。

此外，Biacore 可检测样品的范围十分宽泛，除了常规的蛋白、多肽、抗原、抗体、核酸、有机小分子之外，分子量超高的蛋白复合体、多糖、纳米材料、高分子材料、甚至完整的细胞、细菌、病毒等也同样能够检测，并给出漂亮的数据。

参考文献：

Zhijun Wang, Yanlong Feng, Tiantian Song, Jie Su, Mengjie Fu, and Haiying Lei. Study on the interaction of Zea mays L. centrin and melittin. DOI: 10.1039/D1RA06627G (Paper) RSC Adv., 2021, 11, 36098-36104