2兆道尔顿的分子怎么测？看Biacore如何玩转超级复合体

其中，光反应是由两个包括光合色素在内的光系统完成的，即光系统Ⅰ（简称 PSⅠ）和光系统Ⅱ（简称 PSⅡ）。每个光系统均具有特殊的色素复合体等物质。

光合蓝藻 (Cyanobacteria) 

光合蓝藻是海洋区域主要的有机物初级生产者，并具有光合效率高、生长速度快和易于进行基因改造等优点，是一种理想的基因工程宿主菌，也是光合作用研究的模式生物。在缺铁胁迫下（在自然水生环境中经常发生），蓝藻进化出一种有效的适应与调控机制，大量合成缺铁诱导的捕光天线膜蛋白-色素复合物 IsiA 及黄素氧还蛋白 (Flavodoxin，Fld)，18 个 IsiA 结合在 PSI 的周围，增加 PSI 的捕光效率，同时 Fld 取代 Fd（铁氧还蛋白）从 PSI 接受电子，形成分子量超过 2 兆道尔顿的 PSI-IsiA-Fld 超级复合物。

目前，PSI 和 PSI-IsiA 的结构均已被解析，然而，由于缺乏 PSI-IsiA-Fld 超级复合物的结构数据或其他的互作检测结果，PSI-IsiA 与 Fld 的结合模型还不清楚。

图 1 光反应

近期，植物科学顶级期刊 Nature Plants 在线发表了中国科学院生物物理研究所李梅/常文瑞课题组与章新政课题组在蓝藻光合作用光系统 I 结构基础研究中的最新成果，「Structural basis for energy and electron transfer of the photosystem I–IsiA–flavodoxin supercomplex」。

该研究同时解析了 PSI-IsiA 和 PSI-IsiA-Fld 两种超级复合物的单颗粒冷冻电镜结构，通过 Biacore 技术直接检测了 PSI-IsiA 超级复合体与 Fld 的相互作用并验证了关键氨基酸，为该结合模型的解析提供了核心数据！该项研究结果有助于人们理解蓝藻发挥光合作用及其动态调控的分子机理，并且为在结构基础上开展蓝藻基因工程改造奠定了基础。

图 2 文章截图

先，研究人员解析了 PSI –IsiA–Fld 和 PSI–IsiA 两种超级复合物的单颗粒冷冻电镜结构。通过结构数据，研究人员证明了 PSI–IsiA–Fld 确实存在，并且 Fld 蛋白上的 Tyr 94、Asp 72、Asp 126、Asp 65 是其与 PSI-IsiA 超级复合体相互作用的关键氨基酸。

为进一步验证结构数据观察到的结果，即 PSI–IsiA 通过 Fld 蛋白上的 Tyr 94、Asp 72、Asp 126、Asp 65 四个关键位点与 Fld 形成超级复合体。

研究人员使用 Biacore 8K，将 PSI–IsiA 超级复合体固定在 CM5 芯片上，野生型 Fld 及四个单点突变 Fld（Y94A、D72A、D126A 和 D65A）作为流动相流经芯片表面，采用 Biacore 独有的单循环动力学的方法，检测其亲和力动力学，Biacore 8K 具有 16 组检测通道，在同一芯片，一次实验即可完成所有的互作检测，并且无需摸索再生条件，极大地减少了检测人力、时间与金钱成本。结果显示 Fld 与 PSI–IsiA 能够结合，并且亲和力（KD）为 21 nM，验证了 PSI –IsiA–Fld 超级复合体的存在。

而同一实验中的点突变蛋白的检测结果显示，四个单点突变 Fld（Y94A、D72A、D126A 和 D65A）与 PSI–IsiA 的亲和力分别为 52 nM、49 nM、47 nM 和 73 nM，均弱于野生型 Fld 与 PSI–IsiA 的结合，表明四个单点突变均稍微损坏了 Fld 与 PSI–IsiA 的结合，这一结果与结构数据完全一致。通过比较 Fld-(PSI–IsiA) 亲和力（21 nM）与 Fd-(PSI–IsiA) 亲和力（32 nM），作者指出 Fld-PSI–IsiA 在缺铁条件下为更加稳定的超级复合体。

图 3 Biacore 实验证明，Fld 与 PSI–IsiA 结合形成稳定的超级复合体

在本研究中，Biacore 实验不仅仅证明了 Fld 与 PSI–IsiA 结合形成稳定的 Fld-PSI–IsiA 超级复合体，并且验证了关键氨基酸，结合冷冻电镜解析的结构数据，揭示了蓝藻发挥光合作用及其动态调控的分子机理，并且为在结构基础上开展蓝藻基因工程改造提供了重要数据。

在该项研究工作中，研究人员使用 Biacore 成功检测了分子量高达 2M 道尔顿的超级复合体的结合。对于这类超高分子量的样品，同类的检测方法往往束手无策。这一方面由于复合体粒径大，容易产生非特异结合或空间位阻，从而导致检测结果不准。另一方面，由于复合体由多个蛋白组成，复合体的稳定性和活性通常不高，因此结合的信号往往偏低。

这就需要检测技术既要能够在线识别并扣减非特异结合，又要有很高的灵敏度才能检测。而 Biacore 特有的在线参比扣减设计，通过在同一芯片上设置在线的参比通道，能够准确的定量和完全扣除非特异结合，从而确保检测结果准确可靠。同时 Biacore 高达 pg 级的超高灵敏度，甩开同类技术 2 个数量级以上，从而确保了低活性，低响应信号的结合也能精确检测。

作为分子互作「金标准」，Biacore 可检测样品的范围十分宽泛，除了常规的蛋白、多肽、抗原、抗体、核酸、有机小分子之外，分子量超高的蛋白复合体、多糖、纳米材料、高分子材料、甚至完整的细胞、细菌、病毒等也同样能够检测，并给出漂亮的数据。这篇文章也再次证明，对于超高分子量的样品检测，Biacore 绝对说到做到！

而在植物科学研究领域，Biacore 已经广泛应用到激素/信号转导、转录调控、表观遗传学、生物与非生物胁迫、翻译后修饰、抗逆、天然产物活性成分发现与鉴定、农残检测、结构生物学等研究方向或领域，近些年发表的高分文章也如雨后春笋，目前已有上千篇植物科学相关文献发表，成为植物相关科研的必备工具。

1.Cao P, et al. Structural basis for energy and electron transfer of the photosystem I–IsiA–flavodoxin supercomplex. Nat Plants. 2020 Feb;6(2):167-176.