NAD+,NADH,NADP+,NADPH 傻傻分不清楚？Biacore助力NADPH调控表观遗传重大发现

NAD+、NADH、NADP+和NADPH在光合作用、呼吸作用的电子传递链上作为四种重要的辅酶承载着电子传递的作用，正是它们的相互转化，才使得细胞的物质代谢和能量转化正常进行。这四种辅酶分子量和结构高度相似，往往只相差1个氢原子或者1个磷酸基团，而且生理功能上四者往往相互转化、结伴而行，因此这使得传统研究方法很难对它们进行有效区分。所以，近些年来，针对它们的相关研究并未有突破性的研究进展。

近期，中国医学科学院基础医学研究所杜文静研究团队在Nature Metabolism杂志上发表了题为 《NADPH levels affect cellular epigenetic state by inhibiting HDAC3–Ncor complex》的文章。

该研究首次报道了NADPH在调节表观遗传状态和转录中的一种不依赖于其代谢角色的新功能，打破了长久以来科学界对NADPH的功能认知。

图1 文章截图

长期以来，NADPH被认为是抗氧化防御和还原性生物合成的关键辅助因子，但是一些生理现象却表明NADPH的功能远非这么简单。例如，敲低产生NADPH的关键代谢酶（如ME1、ME2），发现细胞整体组蛋白乙酰化和脂肪相关基因转录水平被抑制。为了弄清楚NADPH是如何影响组蛋白乙酰化及基因转录，研究人员进行了详细的分子机制研究，获得了众多发现，其中两项发现尤为突出：

前期的众多证据已经表明ME能够抑制HDAC3的活性，但是其详细机制尚未得知。研究人员通过体外HDAC3酶活实验发现NADPH以剂量依赖性方式降低HDAC3的活性，而Ins（1,4,5,6）P4作为阳性对照可增强HDAC3活性，NADH，NAD+，NADP+却并不影响HDAC3活性（图2）。 这些结果暗示NADPH可能是HDAC3的特定调节因子，并且NADPH可能与HDAC3相结合。

图2 体外HDAC3酶活实验结果

为了能够验证上述猜想，研究人员采用Biacore SPR技术作为验证手段。将HDAC3蛋白共价偶联在CM5芯片上，NAD+，NADH，NADP+，NADPH，Ins（1,4,5,6）P4作为流动相，使用Biacore T200进行了结合活性检测。结果发现，上述四种分子均可以与HDAC3结合，但结合活性相比，NADPH＞Ins（1,4,5,6）P4＞NAD+，NADH，NADP+（图3）。

图3 HDAC3与NAD+, NADH, NADP+,NADPH, Ins(1,4,5,6)P4的Biacore检测结果

研究人员接下来的一项重要工作就是要确定NADPH抑制HDAC3活性的机制。HDAC3需要募集辅助因子Ncor1-DAD或Ncor2-DAD形成复合物才能发挥活性。因此，研究人员猜测NADPH是否干扰HDAC3与DAD的关联。通过构建一系列的突变体，研究结果表明NADPH可能和Ins（1,4,5,6）P4竞争实现与HDAC3结合。

此时，研究人员再次使用Biacore SPR技术进行验证，结果显示：相较于Ins（1,4,5,6）P4，NADPH与HDAC3的亲和力更高（图4）。而NADPH和Ins（1,4,5,6）P4均不和HDAC3突变体结合（图5）。

图4 NADPH与HDAC3结合并干扰HDAC3-DAD复合物的组装

图5 NADPH和Ins（1,4,5,6）P4与 HDAC3突变体的Biacore检测结果

纵观全文，我们可以看到Biacore在此研究中作为验证分子互作的金标准得到广泛应用。

1.相较于体外酶活实验等这类终点法技术，Biacore能够实时、全面、准确地展示分子相互作用的信息。

2. NAD+，NADH，NADP+，NADPH 在结构上高度相似，这就要求检测方法的灵敏度与分辨率要足够高，而Biacore SPR所具备的高灵敏度、高分辨率能够精准分辨相互作用的细微差异，这是市面上其他检测仪器所无法企及的，这也是为什么Biacore SPR能够收录各国药典，并被权威部门作为标准方法进行推荐的原因之一。

Biacore作为分子互作检测的金标准，始终以用户需求为导向，不断加强与用户的合作，相信未来Biacore将会带来更多精彩的科学发现。