Biacore医学应用精选——心脑血管疾病机理研究与药物开发

心脑血管相关疾病，2020年到现在，新冠吸引着全世界的目光，堪称21世纪以来头号传染病。而在已经逐步恢复正常的国内，我们的视线依然应该放在那些重大疾病上，典型的就是心脑血管相关疾病。

去年顶级医学杂志《The lancet》上发表了一篇中国人主要死因的回顾性文章，列举了导致中国人死亡的十大因素。和许多人以为的癌症头号杀手不一样，心脑血管疾病才是头号杀手，排名第一的中风，排名第二的缺血性心脏病，排名第十的高血压性心脏病，它们加起来占据了中国人死亡因素的一半以上。可以说，当前心脑血管疾病已经成为了国人的顶级杀手，其造成的死亡人数要远远超过了新冠。

而作为分子互作的“金标准”，Biacore已经广泛应用于科研和药物开发的各个领域，那么在心脑血管疾病的机理研究与药物开发过程中，又能为科研工作者们提供哪些帮助呢？

早期的研究表明 AnkB缺陷小鼠显现心律失常的症状，与人ANK2基因突变携带者类似，由兰尼定受体（RyR2）相关的肌浆内质网钙离子释放部分调控。然而引起RyR2极度活跃的特殊分子机制尚不清楚。

在这篇文章中，作者发现2A型蛋白磷酸酶（PP2A）可以调控RyR2的去磷酸化。在13种PP2A的调控亚基种，B56α可以控制RyR2的磷酸化状态。AnkB通过作用于B56α能稳定PP2A-RyR2复合体。而ANK2基因突变会影响RyR2的磷酸化，从而提高心脏发病的概率。

因为B56α可以和AnkB作用，作者猜想PP2A活性降低反应出AnkB结合B56α的核心作用。小鼠心脏匀浆的免疫共沉淀实验结果表明RyR2大分子复合体中包含B56α，PP2Ac，AnkB。此外，表达GFP标签-mutant AnkB和mCherry标签-B56α的人胚胎肾293细胞裂解液的免疫共沉淀实验结果表明，AnkB与B56α的结合降低。GST标签-WT AnkB可以将重组B56α蛋白pull down下来，但GST标签-mutant AnkB却降低了与B56α的结合。

更进一步，作者通过Biacore实验检测了AnkB及突变体与B56α的相互作用（图1所示），结果表明mutant AnkB结合B56α的亲和力较WT显著降低。

血栓是是心脑血管失调的主要原因，造成心肌梗塞，中风，不稳定型心绞痛。虽然华法令，肝素等抗凝血剂有一定效果，但也存在很强的副作用。因此新型抗凝血剂的研发对于血栓的治疗至关重要。已有的研究表明蛋白FXa位于内在和外在凝结通路的连接点，可作为新抗凝剂的靶点。而天然产物是药物开发的重要资源，其中异甜菊醇作为一个天然产物，在前期研究中证明对FXa有直接抑制活性，研究者希望以此为基础找到更高效，更低毒性的FXa抑制剂。

研究者将39种异甜菊醇衍生物做药理活性实验，发现化合物22，35，38的IC50明显优于异甜菊醇以及其它衍生物。于是将化合物22，35，38分别与FXa做Biacore分子互作实验，发现三个化合物与FXa都有相似的结合与解离特征，并且亲和力都在μM量级（图2，Table 2）。说明这三个化合物能作为潜在的新型候选抗凝血剂，为后续的药物开发奠定了基础。

脑血管疾病，作为危害人类健康的常见疾病，可以分为出血性和缺血性脑血管疾病。

长春西汀由植物小长春花中提取的长春胺合成，在治疗缺血性脑血管疾病有超过30年历史。作为血管舒张药，长春西汀可以抑制脑部磷酸二酯酶PDE1的活性，提高cGMP水平，放松血管平滑肌，维持或修复脑血管扩张，让血液流入缺血区域。

在另一篇文章中，研究者将42种长春西汀的衍生物进行对PDE1A的抑制活性实验，发现化合物5，6，7，8，21，22，27，28，34，39和42优于长春西汀。接着用Biacore研究这些潜在候选药物与PDE1A蛋白的相互作用，得到高质量的亲和力与动力学数据。并且Biacore分析软件可以将不同化合物的ka，kd，KD值自动生成Kinetics map，纵轴ka反映结合快慢，kd反映解离快慢即复合物稳定性，斜线为等亲和力线，这样不同化合物之间亲和力和动力学的差异一目了然，大大方便了候选药物的筛选。

通过以上几篇应用文献我们不难发现，科研工作者在针对疾病致病机理的研究中，其中分子层面的实验往往都运用了免疫共沉淀和pull-down等传统的互作分析方法，但这些方法只能对分子间的结合有无做初步定性研究，而具体到分子间结合的强弱、快慢等定量比较亲和力和动力学的差异，特别是阐明蛋白不同位点的氨基酸的突变对于互作的影响时，还是需要高灵敏度、高分辨率、数据精准的Biacore来完成。

另外，在药物开发阶段，尤其是小分子药物开发时，Biacore的高灵敏度，能轻松检测低响应值的小分子样品，如异甜菊醇衍生物与蛋白FXa结合的响应值低于10RU，这一响应信号已经低于或接近其他检测技术的极限，只有Biacore能够精确的进行检测，并且能自动生成Kinetics map，各种小分子之间的差异一目了然，从而为后续药物的研发打下坚实的基础。