早筛查，早诊疗，向“为时已晚”说拜拜！

5 月 20, 2022

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4月15日，第28届全国肿瘤防治宣传周正式展开，本次宣传主题为“整合资源，科学防癌”。活动响应《“健康中国2030”规划纲要》要求，首次将宣传重点推向了 “科学防癌，关口前移”、“关注早筛，防患未然”等方面。根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症数据，2020年我国癌症新发病例457万例，每分钟有8人被确诊癌症！通过此次宣传，中国抗癌协会旨在推动癌症防治，倡导做到早预防、早发现、早诊断、早治疗，降低癌症发病率和死亡率。

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌，是全球发病率前十的癌症之一，但它却是全球第二大癌症死亡原因(占所有癌症死亡的9.1%)。肝癌防治过程中最大的挑战，便是往往就诊已晚期，失去接受根治性手术的机会。因此完善肝癌早期筛查对于挽救肝癌患者至关重要。检测血清生物标志物是早期HCC筛查的关键手段。一系列用于HCC诊断的血清生物标志物已被报道，如甲胎蛋白(AFP)，脱氧-γ-羧基凝血酶原(DCP) 、中基蛋白（MDK）和 Dickkopf-1（DKK1）等。DKK1最早于1998年被发现，是典型Wnt信号通路的分泌拮抗剂，在来自HCC及其他癌细胞系的培养基中可以检测到高水平的DKK1分泌。DKK1早期诊断HCC的敏感性为70.9%，特异性为90.5%，是HCC的潜在诊断标志物，是非常好的早期筛查指标。

复旦大学附属华山医院消化科团队在生物分析化学杂志Talanta发表了题为“Developing Slow-off Dickkopf-1 Aptamers for Early-diagnosis of Hepatocellular Carcinoma”的文章，该团队开发了针对Dickkopf-1的慢解离核酸适配体，可配合抗体形成核酸适配体-靶标-抗体的HCC早期筛查ELISA方法，进一步降低筛查成本，提高筛查的效率。在筛选与改造过程中，Biacore为核酸适配体的筛选指标提供了关键数据。

研究人员在以指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)对DKK1核酸适配体文库筛选后，使用Biacore T200将DKK1固定在CM5传感器芯片上，并将候选适配体作为分析物进行亲和力/动力学检测。如图1、2、3及表1所示，筛选获得的三类核酸适配体D5/D10/D17与DKK1的KD分别为12.26nM、24.85 nM、21.81 nM，均在同一数量级，而三者的解离速率却大有不同，其中D10的kd值是D5和D17的10倍。与快速解离的核酸适配体相比，慢解离的适配体可以大大降低基于适配体的临床ELISA检测的假阴性，极大地提高了HCC早期筛查的准确率与效率。

候选核酸适配体D5(图1 ）、D10(图2）与DKK1的亲和力/动力学传感图

表1 候选核酸适配体与DKK1的亲和力/动力学

检测过程中，研究人员使用了包括点印迹法、酶联核酸适配体吸附试验(ELASA)、Pull-down、流式细胞术和Biacore进行检测。结果表明，不同的方法对相同的序列可能会得到不同结果，相互比较后，研究者强烈建议通过使用Biacore完成候选适配体性能验证，因为这种方法同时提供实时的动力学信息。

基于对核酸适配体D10的检测结果，对DKK1核酸适配体文库进一步进行慢解离筛选，获得适配体D10的突变体C29T，及C29T基础上34位缺失的34del。研究人员使用Biacore以及上述已固定DKK1的CM5传感芯片，以C29T、34del作为分析物，对全新的候选适配体进行亲和力/动力学检测，结果如图4、5及表2所示。候选核酸适配体C29T与34del的KD分别为8.062nM、371.9 pM，比适配体D10的亲和力提高了3.1倍和66.8倍。除此之外，适配体34del的kd已经达到了7.374×10-5s-1，获得了极慢解离的核酸适配体。在对其进行结构预测后，证明截短序列可以进一步提高结合能力，并在其基础上进一步截短，获得全新优化的核酸适配体TD10，将其用于后续HCC筛查。

候选核酸适配体C29T（图1）、34del（图2）与DKK1的亲和力/动力学传感图

表2 慢解离候选核酸适配体与DKK1的亲和力/动力学

后续实验中，研究人员使用优化后的DKK1核酸适配体TD10，将其与商业化HCC早期筛查抗体试剂盒进行对比，发现两者检测范围均能达到62.5 ~ 4000 pg/ml，并且使用基于适配体的ELISA的DKK1水平相对于传统方法而言，可以通过修正系数进行调整。此外，基于适配体的ELISA可以进一步降低筛查成本，提高筛查效率，为肝癌早期筛查进一步助力。

在该研究中，研究者使用了不同检测方法后，强烈推荐使用Biacore对适配体性能进行筛查，因为Biacore不仅仅提供亲和力检测数据，同时还呈现了动力学数据，ka表示结合速率常数，代表结合快慢；kd表示解离速率常数，代表解离快慢，通过kd的数据比较获得了优选的慢解离核酸适配体。同时，由于Biacore的动力学检测范围非常广，并且具有极佳的基线稳定性，对于高亲和样品的检测毫无压力，非常适合pM亲和力级别的核酸适配体筛选。除此之外，由于Biacore的传感芯片可以在保证固定分子活性情况下，无限次使用，所以在多批次多类型候选适配体检测过程中，只需要使用1/2块CM5芯片，如果是基于Biacore 8K Series系统，只需要使用1/8块CM5芯片，大大降低研发成本。

在助力核酸适配体筛选之余，Biacore也同样助力各类不同癌症早筛方法的建立。

日本千叶县癌症中心的研究团队，使用Biacore发现KRAS5可以作为特异性富集因子，富集ctDNA中的KRAS突变，并使用dPCR进行检测，大大提高了筛查灵敏度，在早期ctDNA水平较低的情况下，建立了结直肠癌患者的早期筛查和诊断方法。
日本东部国家癌症研究中心的研究团队，使用Biacore发现了组织因子（TF）的单链抗体，可以作为免疫探针，配合MRI、PET等分子成像技术，实现对胰腺癌、胃癌、脑癌等各类实体瘤的早筛。

同时，Biacore也致力于为各类癌症早筛提供直接检测方案。

加州大学洛杉矶分校的研究团队，使用Biacore开发了一种针对唾液样本的直接检测方法，通过使用抗体三明治法对样本中的IL-8进行检测，仅需13分钟即可得到结果，为口腔鳞癌患者的早筛提供了极大的便利。
澳大利亚格里菲斯大学的研究团队就使用Biacore开发了一种临床样本的直接检测方法，使用该方法检测乳腺癌患者的血清样本，确定了Neu5Gc是乳腺癌筛查与监测的重要生物标志物，为乳腺癌早筛提供依据与方法。

作为分子互作的金标准，Biacore在三十多年的积淀中，为各类癌症疾病的筛查、诊断、治疗等领域提供技术支持，为人类健康提供了核心助力。

参考文献：

[1] Yin, Zhou, Wenshuai, et al. Developing slow-off dickkopf-1 aptamers for early-diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Talanta, 2019.
[2] Enrichment technique to allow early detection and monitor emergence ofKRASmutation in response to treatment[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1).
[3] Sato R , Obonai T , Tsumura R , et al. Preparation and characterization of anti-tissue factor single-chain variable fragment antibody for cancer diagnosis[J]. Cancer Science, 2015, 105(12).
[4] Yang C Y , Brooks E , Li Y , et al. Detection of picomolar levels of interleukin-8 in human saliva by SPR[J]. Lab on a Chip, 2005, 5(10):1017-1023.
[5] Shewell L K , Day C J , Kutasovic J R , et al. N-glycolylneuraminic acid serum biomarker levels are elevated in breast cancer patients at all stages of disease. 2021.