Biacore检测蛋白与小分子相互作用的常见问题（下）

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什么情况下需要进行溶剂校正？

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如何进行溶剂校正？

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如何判断溶剂校正的结果是否正常？

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应该选择哪种拟合模式？

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如何判断拟合结果的好坏？

拟合得出的KD值（即拟合曲线中竖线所在的横坐标值）应该尽可能落在分析物浓度范围之内，最好在最高浓度的一半以内。

当拟合得到的实际R_max值显著高于理论计算值时，说明结合反应未按照1：1的化学计量比进行，有可能出现了非特异性结合或者分析物分子的聚集。对于小分子样品来说，往往由于溶解度等问题发生聚集导致上述现象。而造成拟合得到的实际R_max值低于理论计算值的原因，主要还是偶联的配体中有一定比例的分子未充分暴露结合活性。如果上述两种情况同时存在，此时仅通过R_max值难以判断，需要通过其他实验结果来验证。

offset代表的是零浓度时的响应值，这个值应该趋近于0；如果出现了异常高的值或者负值，需要检查参比通道和零浓度的响应值 ^[3] 。

Chi²值反映了拟合结果与实验数据的接近程度，这个值越小，代表实验结果与拟合模型越接近。

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 关于非特异性吸附的问题

改变芯片表面或者分析物的性质。比较直接的方法是调换配体与分析物的位置，即固定会发生非特异性吸附的原分析物，将原配体作为分析物流经芯片表面进行分析。然而在蛋白与小分子的互作实验中，固定小分子会面临诸多问题（如上篇中所述），因此这个方案在解决小分子的非特异性吸附中不常用。其次可以考虑改变参比通道的处理方法。在使用CM系列芯片偶联配体进行检测时，参比通道可以不作任何处理，也可以进行活化与封闭。这两种处理方式下的芯片表面性质有所不同，改变处理方式或许可以减弱非特异性吸附。另外，非特异性吸附的来源还可能是分析物中的杂质，那么提高分析物的纯度可能也有助于减弱这种吸附。

改变缓冲液条件抑制吸附的发生。非特异性吸附发生所依赖的作用力主要就是离子型相互作用或者疏水型相互作用，前者可以通过提高离子强度来抑制，而后者可以通过添加一定浓度的表面活性剂进行屏蔽。常规缓冲液中NaCl浓度在150 mM附近，可以考虑在原运行缓冲液中额外添加盐（至~300 mM甚至500 mM）。Cytiva提供含有表面活性剂P20的运行缓冲液，工作浓度一般为0.05%。需要注意的是，在提高盐浓度或者加入表面活性剂的过程中，配体与分析物的相互作用可能也会受到一定程度的影响。

调整分析物的浓度范围。非特异性吸附往往呈现出非常明显的浓度相关性。对于小分子分析物，有可能发生的情况是，当浓度达到某个值以上时，小分子的溶解情况出现变化，容易发生聚集沉淀等问题，导致非特异性吸附的信号陡然上升。对于上述情况，可以考虑调整分析物的浓度范围，将非特异性吸附的信号控制在相对不显著的范围之内进行实验。当然，分析物的浓度范围的确定还要考虑KD拟合的需要（如上篇中所述），因此这个方法不一定能找到合适的浓度范围。