全新的Poly进样模式助力复合物形成机制研究

绝大多数蛋白质以多聚体复合物的形式而不是单个蛋白质的形式参与许多细胞过程。随着蛋白质组学的发展，数千种蛋白质复合物被鉴定出来，并且复合物的数量还在持续增长。一些蛋白质复合物是稳定的，而另一些复合体是天然不稳定的，只在一瞬间存在。

为了更好地助力各类复合体形成机制的研究，Biacore开发了全新的Poly进样模式，改进样模式允许五次连续顺序进样，这五次进样之间无需任何洗涤步骤，避免了传统进样模式引入的解离。

全新的Poly进样模式

新一代的Biacore 1系列分子互作分析系统在Buffer-sample、Dual、ABA进样模式的基础上，创新性地增加了Poly进样模式。Poly命令可按顺序进样3~5个样品，无需中间洗涤步骤，适用于研究蛋白质复合物的形成（图1）。接下来小编将给各位分享两个Poly进样模式在复合物形成研究中的应用实例。

图1：Poly进样模式示意图，显示五个样品 (Solution A-E) 顺序进样

案例一

DNA错配修复复合物的形成

DNA错配修复是一种高度保守的生物学途径，用于检测和去除复制过程中引入的DNA错配，维持基因组稳定性。DNA错配修复复合物形成主要有三个阶段（见图2中步骤1/2/4）：

首先MutS与DNA中错配位置结合。
随后MutS募集MutL。
最后MutL招募UvrD结合，从而进行DNA修复。为验证DNA错配修复复合物形成的过程，我们可以采用Poly进样模式，完美还原了组装顺序。

图2：大肠杆菌DNA错配修复的示意图

首先，将含有核苷酸错配的DNA通过Biotin标记固定在S系列SA芯片上。我们使用Poly命令，先饱和进样MutS（200 nM MutS，溶液A），然后进样MutS和MutL的混合物（各200 nM，溶液B），最后进样MutS、MutL和不同浓度的UvrD（200 nM MutS，200 nM MutL和0-1024 nM UvrD，溶液C）。Poly进样模式完全验证了DNA修复复合体三个组分的组装顺序（图3）。

图3：Poly进样模式确认DNA修复复合体各组分的组装顺序

案例二

新冠相关蛋白复合物中各组分的结合依赖性

该新冠相关蛋白复合物由新冠病毒刺突蛋白受体结合域 (RBD) 、RBD受体 (ACE2) 、结合RBD的抗体CR3022 (α- RBD) 、抗人抗体 (α-Human) 组成。那么该复合物中各组分结合依赖性如何呢？首先，将RBD固定在S系列CM5芯片上。紧接着，Cycle 1：使用Poly命令顺序进样α-RBD (10 nM) 、ACE2 (750 nM) 和α-Human (10 nM) 。Cycle 2-4：每个循环中，一个组分用Buffer代替（图4）。

图4：Poly进样模式研究新冠相关蛋白复合物中各组分的结合依赖性

进一步数据分析，用Cycle 1的传感图分别减去Cycle 2、3、4传感图，揭示复合物中各组分的结合依赖性（图5）。Cycle 1 minus Cycle 2的结果表明α-RBD (Solution A) 和α-Human (Solution C) 结合。Cycle 1 minus Cycle 3仅显示ACE2 (Solution B) 的结合，因为α-RBD (Solution A) 和α-Human (Solution C) 的结合已被减去。Cycle 1 minus Cycle 4显示只有α-Human (Solution C) 结合。特别注意，如果α-RBD (Solution A) 没有先结合，则α-Human (Solution C) 是不可能发生结合的。

图5：Poly进样模式获得的数据扣减后评价结合依赖性

Poly进样模式总结

满足对更先进的分析工具的需求，用于表征复合物的形成

支持3~5种组分的顺序进样，最大限度地减少进样之间的解离时间

可用于分析多个分子间的结合依赖性

参考文献：

Cynthia S, Alexander F, Elin S, Linnea N, et al.Visualize your research – SPR for protein complex formation studies. 官方材料链接KZCx_Xxvx0-OzoZ3bfpzpg-pdf (cytivalifesciences.com)

Fernandez-Leiro R, Bhairosing-Kok D, Kunetsky V, et al. The selection process of licensing a DNA mismatch for repair. Nat Struct Mol Biol. 2021;28(4):373-381. doi:10.1038/s41594-021-00577-7

Yuan M, Wu NC, Zhu X, et al. A highly conserved cryptic epitope in the receptor binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science. 2020;368(6491):630-633. doi:10.1126/science.abb7269