一文教你玩转抗原表位分析 | 思拓凡学堂中国官网

治疗性抗体药物是生物制药行业的重要研究领域，从1986年FDA批准第一批单克隆抗体起，目前已有超过一百种抗体药物获批上市，抗体类药物每年占FDA新药批准的近五分之一1。抗体类药物被批准用于治疗包括癌症、自身免疫、代谢和传染病在内的各种疾病，而选择具有适当亲和力、特异性和生物物理特性的抗体至关重要。依赖于无标记、实时检测、高通量的技术优点，Biacore分子互作系统贯穿在抗体药物开发的全流程。

抗体的早期筛选通常会产生很多候选物，而同一表位的抗体通常具有相似的功能，将抗体通过表位分组可以进一步缩小研究范围。此外，表位分析在单抗专利保护中也至关重要2。Biacore Insight software包含完整的抗体筛选-动力学/亲和力表征-抗原表位分析模块（☞ Biacore实验指南（二）| 抗体筛选类实验，这么做更高效! ），满足早期药物发现的各种互作检测需求。

Biacore Insight software内置的抗原表位分析 (Epitope binning) 模块包含：

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夹心法 (Sandwich)

1

预混法 (Premix)

1

串联法 (Tandem)

图1：抗原表位分析的实验方法示意图a夹心法、b预混法、c串联法

夹心法表位分析的第一步是通过直接偶联或捕获的方法固定A抗体，然后依次结合抗原和B抗体。要注意的是，若使用捕获法，需要避免捕获分子与B抗体的结合。夹心法通常是第一选择，但对于多价抗原则需要单独的封闭步骤，及考虑A抗体与抗原的解离快慢。使用Dual injection，可以连续地进样抗原和B抗体，最大程度减少抗原与A抗体的解离，保证实验结果的可靠性。

图2：夹心法Dual injection的典型传感图

在夹心法检测结果（图2）中，抗原首先结合在A抗体上。若B抗体与A抗体结合在抗原不同表位上，则B抗体仍能结合芯片上的抗原，表现为蓝色曲线；若B抗体与A抗体结合抗原同一表位，B抗体将不能结合在抗原上，表现为红色曲线。通过调换A B抗体的顺序，可以检测二者是否双向竞争，给出准确的表位分组。

预混法

预混法表位分析同样可通过直接偶联或捕获的方法固定A抗体，抗原则与过量的B抗体（确保B抗体饱和结合抗原）预孵育，然后进样混合物，检测混合物与A抗体的结合信号。预混法可应用于单价或多价的抗原检测，数据更加简单，常用作夹心法的补充。使用捕获法时同样要避免捕获分子与B抗体的结合。

图3：预混法的典型传感图

预混法检测结果中，若B抗体与A抗体结合在抗原不同表位上，则抗原-B抗体复合物可以结合芯片上的A抗体，表现为蓝色曲线；若B抗体与A抗体结合抗原同一表位，抗原-B抗体复合物将不能结合在A抗体上，表现为红色曲线。

串联法

串联法表位分析的第一步是通过直接偶联或捕获法将抗原固定在芯片上，然后依次进样A抗体和B抗体。串联法同样可应用于单价或多价的抗原检测。使用直接偶联法时抗原消耗少，但抗原表位可能不会充分暴露。

图4：串联法的典型传感图

串联法检测结果中，首先使A抗体尽量饱和抗原位点，若B抗体与A抗体结合在抗原不同表位上，则B抗体仍能结合芯片上的抗原，表现为蓝色曲线；若B抗体与A抗体结合抗原同一表位，则B抗体不能结合在抗原上，表现为红色曲线。

在夹心法和串联法中，也可以同时在第二步进有A抗体背景的B抗体（二者的混合物）3来规避掉A抗体与抗原的解离。

数据分析

抗原表位分析中，往往会产生上百组甚至更多的数据结果，借由Biacore Insight软件强大的数据分析功能，仅需简单的点击，选择对应的数据分析方法模块，即可对庞大的数据进行自动分析，并生成Heat map及bin chart，直观显示各个抗体间的竞争关系及表位分组（图5）。

图5：抗原表位分析结果-Heat map及Bin chart

Heat map中，Y代表第一个进样的抗体，X代表第二个进样的抗体。红色填充的方格代表二者互相阻断与抗原的结合，白色填充代表二者互不影响对方与抗原的结合，黄色填充则代表不确定。点击方框即可查看该组试验传感图以进一步分析，并可在传感图上调出boundary line来调整上限和下限。若A抗体可阻断B抗体与抗原的结合，但B抗体不能阻断A抗体，则在方格中显示箭头标记。黑色线框代表同一抗体。
Bin chart将结合同一表位的抗体分为一组，同表位组的抗体显示在同一个颜色的扇形中，部分重叠的表位组相邻排列，形成簇，独立的表位组间由空白间隔区分。组之间的虚线表示不确定的竞争，箭头表示单向或双向竞争。Bin chart提供直观、丰富的抗原表位信息，有利于针对性的抗体开发。

借由Biacore 8 series设备，8×8组实验在2小时内即可完成检测（预混法），软件自动对所有数据进行抗原表位分析，生成直观的Heat map及Bin chart，加速实验开展，简化分析流程。

Biacore基于法规认可、药典收录的SPR技术，助推了各类型药物的申报和上市。2022年FDA批准的抗体药物中，超过80%均使用了Biacore数据做审批。Biacore完善的药物开发全流程检测，一台设备即可完成药物开发中的所有互作检测。全自动、高通量保证检测速度，无标记、高灵敏保证数据质量，未来 Biacore定将助推更多药物上市，推动全人类健康事业。