“芯”发现：CM系列芯片的多种玩法

Biacore作为一种非标记分子互作技术，方便大家在开展实验的时候，无需样品前处理或者无需对样品进行任何标记。Biacore芯片巧妙的设计，可以利用样品上的各种基团，简单、便捷地固定样品。固定样品的方式非常多，其中最简单的便是氨基偶联法（直接法）。除了氨基偶联方法外，还可以通过醛基偶联、巯基偶联、马来亚酰胺偶联等方法，那么就让我们一起来盘点一下，各类偶联方法是如何实现对配体的固定吧！

氨基偶联

氨基偶联是将生物分子共价固定于传感芯片表面时使用最广泛的方法。CM3、CM4、CM5、CM7、C1、PEG芯片均可利用配体上的氨基来进行共价固定。氨基偶联原理如下图所示，传感芯片表面的羧基首先被EDC和NHS的混合物活化，从而生成具有反应活性的琥珀酰亚胺酯。然后，将配体分子流经传感芯片表面，琥珀酰亚胺酯与配体的伯胺基团或其他亲核基团发生反应，将配体共价连接于芯片上。

图1：通过氨基偶联固定配体的化学原理

相信各位老师对氨基偶联的方法也不陌生，那么我们带各位老师来温习一下。

推荐的氨基偶联程序

1

配体富集：确定最佳的预富集条件，以富集足够的蛋白到芯片表面；

2

实验条件：推荐使用流速5-10 ul/min；

3

活化芯片：进样1:1混合的EDC/NHS溶液6-10 min，如果是PEG芯片，进样混合溶液30 s即可；

4

配体固定：进样配体5-10 min，配体浓度推荐10～100 ug/ml；

5

芯片封闭：进样乙醇胺6~7 min。

这里所推荐的实验条件常用于一般目的的固定需求。配体浓度和进样时间是可以用来控制配体固定量的两个主要因素。如果偶联水平太高，可通过：

减少配体浓度；
减少进样时间；
减少活化时间来控制偶联量。如果需要较少的偶联量 (<500 RU) ，可尝试EDC/NHS以20%/80%混匀，活化30 s即可。

另外，Biacore还可以通过Aim for immobilized level程序实现目标量偶联，无需费心摸索，仪器轻松自动固定配体至合适的偶联量。

氨基偶联如果顺利完成，典型的传感图如下所示：

图2：利用氨基偶联固定配体的典型传感器图

大部分蛋白质含有多个氨基基团，因而可在不严重影响配体生物学活性的前提下进行有效的固定。但是，在某些情况下，氨基偶联中参与反应的氨基可能涉及到配体的活性位点或结合位点附近的基团，因此可能在固定之后导致配体活性的丧失。另外，酸性蛋白由于很难被预富集，无法通过氨基偶联固定在芯片上。在这些情况下，可尝试使用其他偶联化学反应（如巯基、醛基、马来酰亚胺等）固定配体。

巯基偶联

由于蛋白质序列中巯基的数量通常少于氨基（有些蛋白质序列中仅有一个巯基位点），因此，巯基偶联方法有助于以确定的取向固定配体分子。在表面巯基偶联中，由于通过PDEA试剂代替了羧基而在配体分子中引入有反应性的二硫化物，从而提高蛋白质的等电点，改进了静电预富集效果，因此，表面巯基法还可用于酸性蛋白质的固定。

巯基偶联方法利用了巯基和活性二硫化物基团之间的交换反应。当活性二硫化物被引入到芯片葡聚糖基质上，而配体提供结合的巯基，这类方法称为配体巯基法。另一种方式，芯片葡聚糖基质上的巯基与配体的二硫化物结合时，则称为芯片表面巯基法。CM3、CM4、CM5、CM7、C1芯片均可实现巯基偶联。

配体巯基偶联

本身含有巯基的配体蛋白可利用本方法固定在芯片上，利用PDEA将反应性二硫化物基团引入到传感芯片的葡聚糖基质上，实现两者的共价结合。

图3：通过配体巯基偶联固定配体的化学原理

那么配体巯基偶联要怎么实现呢？推荐的实验流程如下：

1

配体富集：确定最佳的预富集条件，以富集足够的蛋白到芯片表面；

2

实验条件：流速5-10 ul/min；

3

芯片活化：进样1:1混合的EDC/NHS溶液2 min；

4

引入二硫化物基团：进样PDEA 4 min；

5

配体固定：进样配体6～7 min；

6

芯片封闭：半胱氨酸-NaCl 4 min。

配体巯基偶联如果顺利，那么传感图如下图所示：

图4：串联法的典型传感图

芯片表面巯基偶联

芯片表面巯基偶联法是将巯基引入到传感芯片的葡聚糖基质上，并将反应性二硫化物引入到配体分子上。通过巯基-二硫化物交换反应实现配体与芯片表面巯基的偶联。

图5：通过配体巯基偶联固定配体的化学原理

那么实验第一步，就是用PDEA对配体进行修饰，让配体带上反应性二硫化物，此过程还可以提高配体的等电点。推荐实验步骤如下所示，如有需要，可缩小溶液体积。

1

在25°C下，用0.5 mL 0.1 M的MES缓冲液 (pH5.0) 配制1 mg/mL的配体溶液；

2

在MES缓冲液中加入0.25 mL 15 mg/mL PDEA（PDEA的最终浓度为22 mM）；

3

加入25 µL 0.4 M EDC（EDC的最终浓度为13 mM）；

4

混合，并在25°C孵育10分钟或在冰上孵育1小时；

5

通过适当的缓冲液置换方法去除过多的试剂。

实验第二步，我们需要测定修饰配体的程度。对于PDEA修饰的蛋白质来说，可以通过二硫键的还原和释放的硫代吡啶酮的分光光度法评估结果（最大吸光度波长为343 nm）来大致测定修饰的程度。

1

于280 nm (A280) 和343 nm (A1343) 波长处测定修饰蛋白质的吸光度；

2

在1 ml蛋白溶液中加入50 μl 100 mM的DTE水溶液。混合并于室温反应数分钟；

3

再次测定343 nm波长处的吸光度 (A2343) 。按照下式计算修饰的程度：

图6：计算修饰配体程度的公式

实验第三步，就可以偶联配体了，推荐的实验程序如下：

1

实验条件：流速5-10 ul/min；

2

芯片活化：进样1:1混合的EDC/NHS溶液2 min；

3

引入二硫化物基团：注入胱胺3 min；

4

二硫化物还原：注入DTE 3 min；

5

配体固定：进样配体6~7 min；

6

芯片封闭：注入PDEA-NaCl 4 min，封闭芯片表面。

图7：利用表面芯片巯基偶联固定配体的典型传感器图

马来酰亚胺偶联

在巯基-二硫化物交换反应中，偶联的共价键在还原剂存在或高pH值条件下不稳定，因此，利用该反应进行的配体固定不适用于传感芯片表面暴露于还原剂或高pH值环境的实验。利用配体上的巯基进行共价固定的另一种方法为马来酰亚胺试剂所介导的偶联，这个反应可在配体和葡聚糖基质之间形成硫醚键。CM3、CM4、CM5、CM7、C1芯片均可实现巯基偶联。

用氨基偶联化学反应将乙二胺偶联于传感芯片表面，形成具有氨基基团的表面。硫代-GMBS与氨基反应形成具有马来酰亚胺基团的表面，从而可用来固定含有巯基的配体分子（图4-16）。需要注意的是，氨基表面并不稳定，应在制备之后直接用硫代-GMBS失活。

图8：通过马来酰亚胺偶联固定配体的化学原理

马来酰亚胺偶联程序

1

配体富集：确定最佳的预富集条件，以富集足够的蛋白到芯片表面；

2

实验条件：流速5-10 ul/min；

3

芯片活化：进样1:1混合的EDC/NHS溶液6~7 min；

4

引入氨基基团：注入乙二胺溶液6~7 min；

5

引入马来酰亚胺：注入硫代-GMBS 4 min；

6

配体固定：进样配体6~7 min；

7

芯片封闭：半胱氨酸-NaCl 4 min。

如果芯片马来亚酰胺偶联顺利完成，典型的偶联图如下：

图9：利用马来酰亚胺偶联固定配体的典型传感器图

醛基偶联

醛基偶联方法为固定糖蛋白和其他复合糖提供了一种方法。唾液酸残基极易被高碘酸钠氧化生成醛基，因此该方法尤其适用于含唾液酸的配体。含醛基的配体（天然的或由顺二醇氧化而引入）可在传感芯片表面被酰肼或碳酰肼活化之后被固定。CM3、CM4、CM5、CM7、C1芯片均可实现醛基偶联，其化学原理如下图所示。

图10：通过醛基偶联固定配体的化学原理

在固定之前，可使用高碘酸钠氧化法在含顺二醇的配体分子中引入醛基。这一步称之为氧化配体，推荐的程序如下：

1

在100 mM醋酸钠缓冲 (pH5.5) 中制备被氧化配体的1 mg/ml的冷溶液；

2

加入1/50体积的高碘酸钠溶液（高碘酸盐终浓度为1 mM），于冰上孵育20分钟；

3

在脱盐柱上用10 mM醋酸钠缓冲 (pH4.0) 对混合液脱盐以终止反应。

氧化好的配体可按照推荐的程序进行偶联；

1

配体富集：确定最佳的预富集条件，以富集足够的蛋白到芯片表面；

2

实验条件：流速5-10 ul/min；

3

芯片活化：进样1:1混合的EDC/NHS溶液3 min；

4

引入酰肼基团：注入碳酰肼水溶液6~7 min；

5

失活过剩的反应性基团：注入乙醇胺 6~7 min；

6

配体固定：进样配体6~7 min；

7

稳定结合：氰基硼氢酸盐20 min，流速建议使用2 ul/min。

如果醛基偶联顺利，你将会看到以下典型的传感图：

图11：利用马来酰亚胺偶联固定配体的典型传感器图

小结

看了以上这么多的共价偶联方式，想必各位老师已经跃跃欲试想要尝试一下了。基于非标记技术的Biacore分子互作检测，根据各位老师的样品情况，可以有多种方法固定配体，不仅有氨基偶联，还有巯基偶联、马来酰亚胺偶联，醛基偶联这类进阶玩法，如果您的样品比较与众不同，不妨试一试各类偶联方式，在Biacore上创建您的新偶联方法吧！