Biacore实验指南（一）| 竞争分析类实验，这么做更省力！

某周一早上

手机传来信息提示音：滴~滴~滴~

客户W

荣工，Biacore能否检测竞争抑制呢？有没有protocol呢？

客户W

例如药靶蛋白、受体蛋白和抑制剂（小分子）之间的竞争分析。

小荣

这方面的应用蛮多的，Biacore完全支持相关的实验内容哟！使用A-B-A、Dual injection等进样模块就可以设计实验方案啦，省时省样本；无论是定性类、还是定量类实验，Biacore通通都能解决呢！

客户W

好滴好滴，您抽空方便分享一下呀。

小荣

没问题，稍等片刻~

01. 定性实验-竞争抑制

实验一：肝素 (Heparin)

中南大学湘雅三医院吕奔教授团队围绕脓毒症的发病机理及靶向干预开展了系列研究，揭示了脓毒症重要的致病机制，为脓毒症的诊治提供了潜在的生物标志物和药物干预靶点，并针对该靶点进行药物筛选，为今后脓毒症的防治提供了新的思路。

2021年，吕奔教授研究团队在Immunity杂志上发表文章，针对前序研究中发现的HMGB1-LPS-caspase-11途径，筛选出肝素 (Heparin) 能高效并选择性地抑制Caspase-11活化，并阐明了肝素在脓毒症中能通过抑制Caspase-11的活化防止脏器损伤、DIC发生和死亡的机制。

观察图1的动力学表征数据可知，肝素与HMGB1有较强结合，Kd=5.59*10^-6 M。同时，通过多浓度梯度进样的实验设计，可以看出LPS+Heparin实验组相较LPS对照组，与包被有HMGB1蛋白的芯片的响应值 (Response, RU) 显著降低，即可看出Heparin可以抑制LPS与HMGB1的识别/结合。

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图1：肝素可抑制HMGB1与LPS结合^[1]

实验二：Tuftsin

北京大学王月丹与初明教授团队围绕着新冠病毒的防治工作筛选到了一种天然产物Tuftsin，相关成果也于2022年发表在Frontiers in Molecular Biosciences杂志上。Tuftsin是机体脾脏产生的一段生理活性肽，其基本功能是刺激巨噬细胞和粒细胞，提高促吞噬的能力；可以通过增强效应细胞的细胞毒功能杀伤肿瘤细胞等，在抗感染方面具有不可替代的作用。

通过多轮的化药库筛选、分子对接等实验，课题组筛选到Tuftsin分子。随后，使用Biacore体外验证了其与ACE2分子及抑制的效应分子NRP1的亲和力，结果表明Tuftsin能特异性识别并结合ACE2分子。

此外，研究人员通过多浓度梯度进样的实验设计，将S1蛋白固定在CM5芯片上，设置ACE2 (5 nM) 对照组及Tuftsin+ACE2（ACE2为固定浓度，5 nM; Tuftsin设置9/156/625 nM）实验组；结果表明，Tuftsin浓度越高，结合响应值 (Response, RU) 越低，即证明Tuftsin可有效阻断/抑制S1与ACE2的识别与结合。

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图2：Tuftsin可抑制S1与ACE2结合^[2]

实验三：黄连素 (Berberine，BBR)

首都医科大学和北京中医药大学的科研团队在传统中药中筛选特异性抑制凝血酶的小分子抑制剂，最终得到的黄连素 (Berberine，BBR) 被证明可以直接结合凝血酶从而抑制其诱导的血小板聚集。凝血酶 (Thrombin) 是血液凝固级联反应中的关键酶，被认为是多种心血管疾病中重要的药物靶点。

研究人员首先在Biacore上证明了Berberine可以直接与凝血酶结合，两者的亲和力为16.39 μM（图3 A/B），比已上市的抗凝血药阿加曲班 (Argatroban) 的亲和力更高（图3 C/D，KD=53.78 μM）。

图3：Berberine/ Argatroban与Thrombin的结合^[3]

同时，研究人员利用Biacore特有的A-B-A进样设计竞争实验，证明Berberine与Argatroban结合在Thrombin相同的位点上。A-B-A的进样方式简化了竞争实验的设置，允许两种不同的溶液按照溶液A/溶液B/溶液A的顺序在同一个循环内进样，由于竞争样品无需再溶解在运行缓冲液里，大大减少了竞争样品的消耗量，非常适用于药物的竞争分析（图4）。

图4：ABA进样设置Berberine和Argatroban的竞争实验

从图5的实验结果中可以看到：Berberine不存在时，Argatroban与Thrombin有明显的结合信号（图5，red line）；而在300 μM Berberine存在的情况下（A-B-A样品设置参照图4），Argatroban与Thrombin的结合响应值明显降低（图5，blue line）。证明Berberine在Thrombin上的结合位点与Argatroban是一样的。综合后续的血小板凝集实验，这一研究说明Berberine是潜在的安全有效的凝血酶抑制药物。

图5：Berberine和Argatroban竞争实验结果^[3]

02. 定量实验-竞争抑制

实验一：紫草素 (SHK)

NF-κB是一个可诱导转录因子家族，调节多种生理及病理进程。NEMO/IKKβ复合物则是NF-κB信号通路中的中心调节剂。2022年，大连医科大学马骁驰、中国科学院上海药物研究所果德安、中国科学院大连化学物理研究所叶明亮课题组在Signal Transduction and Targeted Therapy杂志上发表了相关成果，筛选到NEMO/IKKβ复合物的潜在抑制剂-紫草素 (SHK) 。

为测得SHK抑制NEMO/IKKβ复合物的IC₅₀，课题组做了相关实验：把MBP-IKKβ蛋白固定在CM5芯片上，再将GST-NEMO+SHK（GST-NEMO为固定浓度，1 μM; SHK设置0~3125 nM）的预混液以多浓度梯度进样的形式流过芯片表面，进行结合信号的采集，拟合作图，测出IC₅₀。

同时，课题组考虑到实验的严谨性，将GST-NEMO作为固定相进行了实验重复。课题组使用Biacore测得了紫草素抑制NEMO/IKKβ复合物的IC₅₀为174 nM，证明其可在体内外抑制NF-κB通路，从而减缓结直肠癌细胞的增殖，为开发有效的小分子PPI抑制剂提供一些新的思路。

伦斯勒理工学院、中国农业大学等单位围绕着绿茶中的抗氧化剂EGCG展开了丰富的研究，并于2021在NATURE COMMUNICATIONS杂志上发表相关成果。文章中阐释EGCG可与p53分子结合并阻断p53与MDM2分子（E3泛素连接酶）的结合，从而抑制MDM2对p53的泛素化、稳定了p53的抗肿瘤活性。

课题组首先使用Biacore测定了EGCG与全长p53、NTD-p53的亲和力，探明了EGCG与p53的识别作用靶点位于p53分子的N末端。同时，课题组将MDM2分子固定在CM5芯片上，探究了MDM2分子与p53的亲和力KD=0.6±0.1 μM。接着使用同一张芯片展开了IC₅₀测试：将p53+EGCG（p53为固定浓度，250 nM; EGCG设置0~500 nM）的预混液以多浓度梯度进样的形式流过芯片表面，进行结合信号的采集，拟合作图，测出IC₅₀=0.2 μM。

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图6：EGCG可抑制MDM2与P53的识别与结合^[5]

读到这，大家是否对竞争抑制类实验有了新的认识呢？Biacore的持续流检测方式，搭配独特的Dual injection、A-B-A进样模块，可支持各类新颖的实验设计。那大家遇到竞争抑制类的实验内容，会做了么？

Biacore作为分子间互作的“金标准”，参与发表的文献已超过5万篇！小小身材的Biacore，既能无惧各类复杂样本及实验设计，又能助力丰富多样的研究方向！

参考文献：

[1] Tang Y, Wang X, Li Z, et al. Heparin prevents caspase-11-dependent septic lethality independent of anticoagulant properties. Immunity. 2021;54(3):454-467.e6.doi:10.1016/j.immuni.2021.01.007

[2] Huang J, Wang J, Li Y, Wang Z, ChuM and Wang Y (2022) Tuftsin: A Natural Molecule Against SARS-CoV-2 Infection.Front. Mol. Biosci. 9:859162. doi: 10.3389/fmolb.2022.859162

[3] Wang, X. et al. Identifcation of berberine as a direct thrombin inhibitor from traditional Chinese medicine through structural, functional and binding studies. Sci. Rep. 7, 44040; doi: 10.1038/srep44040 (2017)

[4] [1] Yu Z , Gao J , Zhang X , et al. Characterization of a small-molecule inhibitor targeting NEMO/IKKβto suppress colorectal cancer growth[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2022(004):007.

[5] Jing Zhao, Alan Blayney, Xiaorong Liu, et al, EGCG binds intrinsically disordered N-terminal domain of p53 and disrupts p53-MDM2 interaction. Nature Communications, 2021, 12 (1).