那些年中检院利用Biacore所发表的文章(上)

11 月 12, 2021

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随着以Biacore为代表的表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance，SPR）先后收录入美国、日本和中国药典，并被推荐用于药物活性浓度定量、亲和力与动力学表征、免疫原性检测等。Biacore已经广泛应用到药物开发的多个环节，截至目前已有上百款药物在研发、生产及申报中都大量使用Biacore。

作为国家检验药品生物制品质量的法定机构和最高技术仲裁机构，中国食品药品检定研究院（NIFDC）同样使用Biacore开发出了多种药物质控检测与分析方法，并成功应用到多种报批药物的审核。除此之外，NIFDC的科研人员还利用Biacore开展多项科研工作，涵盖了抗体、疫苗、小分子等多个研究方向，并且已累计发表数十篇高分文章（见文末参考文献），今天小编精选了几篇应用，带领大家看看来自权威机构的科研风采。

新冠病毒跨种传播机制研究

对于新冠疫情的防控，摆在科学界面前的不确定问题仍有很多，跨物种传播机制是其中重要一环，这有助于寻找真正的中间宿主，监测易感动物，防止其成为新的传播源头，导致疫情再次暴发。

中检院和中科院微生物所的研究人员发现新冠病毒的RBD可以结合狗ACE2受体，SPR结果显示病毒和dACE2的亲和力比hACE2低6.65倍（图1），这与结构生物学的结果一致。

图1 Biacore表征新冠RBD与hACE2及dACE2的亲和力

研究人员进一步结合突变实验确认了病毒与受体结合的关键氨基酸，在病毒RBD引入K417V或者K417N单点突变之后，RBD与dACE2的亲和力分别下降了3.25和4.12倍，与hACE2的亲和力也下降了近3倍（图2）。阐明病毒与宿主细胞受体的相互作用是介导病毒感染的首要步骤，在很大程度上也决定着病毒的宿主范围，因而对该相互作用的研究不仅有助于理解病毒感染，而且对研究病毒的跨种传播及传染病的防控具有重要指导意义。

图2 引入单点突变之后用Biacore检测病毒RBD与ACE2受体的亲和力

持续助力新冠抗体的研究

虽然国内新冠疫苗已经得到了广泛普及，但疫情却时有反复，境外输入病例和国内零星病例的出现已经成了新常态，因此国内科研人员对于新冠治疗性药物的研发并没有停下脚步。

近日中检院王佑春研究员团队与华中科技大学以及中科院微生物所的科研人员合作，成功开发出了靶向ACE2的单克隆抗体h11B11，并对其进行了人源化改造。该抗体显示出了对SARS-CoV，SARS-CoV-2及变异病毒良好的抑制作用。其中鼠源和人源化改造后的抗体分别与不同种属的ACE2受体的结合的关键性数据就是由Biacore提供。结果显示人源化改造后的的抗体h11B11与hACE2的亲和力与未改造的鼠源抗体一致（图3ab）。

由于h11B11也能够与食蟹猴的ACE2结合（图3c），因此研究人员选择用食蟹猴进行动物实验，评估h11B11抗体在体内的安全性。结果显示该抗体不仅具有明显的抗病毒效果，而且具有很好的安全性，是一种潜在的新冠治疗药物。

图3 Biacore表征鼠抗11B11与人ACE2的结合（a），以及人源化之后的该抗体h11B11与人ACE2（b）和食蟹猴ACE2（c）之间的亲和力

2021年中检院与迈威生物等单位联合报道了另一种针对新冠病毒RBD的单克隆抗体MW05，相关文章发表在NATURE COMMUNICATIONS上。在该研究中，他们同样使用Biacore检测了两种单克隆抗体MW05和MW07分别与病毒RBD的亲和力。从图4可以看到，它们之间的亲和力分别为0.403nM和0.462nM，并且两种抗体与靶点的解离速率都很慢。Biacore稳定的基线保证得到了最准确的解离段数据。

研究发现抗体MW05通过Fc段与靶细胞表面的特定受体（FcγRIIB）结合，引起ADE效应。经过改造在MW05的Fc段引入了LALA突变（MW05/LALA）消除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）后，该抗体在动物实验中展现了良好的抗病毒效果。

图4 Biacore表征抗体与病毒RBD之间的亲和力

新冠抗体鸡尾酒疗法的探索

今年，中国食品药品检定研究院王佑春和黄维金团队在Cell Discovery上发表文章，提出了一种新冠抗体的鸡尾酒疗法，能够有效避免由于病毒突变造成的逃逸。

研究人员用病毒RBD免疫小鼠，并筛选出有多个有抑制效果的单克隆抗体。随后研究人员用Biacore验证了这些抗体和病毒RBD的结合（图5a），以及这些抗体是否阻止RBD和ACE2受体的结合（图5b）。从图5b可以看到，在抗体存在的情况下（红线），均明显降低了ACE2结合RBD的能力，说明这些抗体都具有中和活性。

图5 Biacore表征抗体与RBD结合的亲和力（a）以及抗体的中和能力（b）

抗体鸡尾酒疗法的思路是通过混合识别不同表位的抗体，从而降低变异病毒躲避单抗体治疗的能力。那么如何确定这些中和抗体的表位呢？研究人员同样利用Biacore对所筛选到的中和抗体的表位进行了两两分析。他们通过Anti-His抗体将带His标签的病毒RBD固定在芯片上，然后进样第一个抗体将RBD饱和，再进第二个抗体，通过比较单独进抗体2时下降的响应值，得到中和抗体结合表位的信息（图6）。

图6 Biacore研究中和抗体结合表位

结果显示，这些抗体结合RBD四个不同的表位，研究人员混合三种不同表位的抗体，在假病毒实验中验证得到了预期的抗病毒效果，为新冠抗体鸡尾酒疗法的开发奠定了坚实的科研基础。

同样是抗体鸡尾酒疗法开发，中检院与中国疾控等单位同样利用Biacore对一系列抗体和病毒RBD的亲和力进行筛选（图7），得到了两个高亲和力抗体F61 和H121。并在此基础上展开的抗体鸡尾酒疗法显示了对SARS-CoV-2病毒及其突变体的广泛抑制作用。

图7 Biacore检测一系列抗体和新冠RBD之间的亲和力

探索新的新冠治疗方法

除了目前非常火热的中和抗体研究之外，中国食品药品检定研究院的科研人员还将目光集中到植物中提取的蛋白对于新冠病毒的抑制作用研究上。他们同样利用Biacore精确表征了12种不同植物中提取的凝集素与新冠病毒S蛋白间的亲和力与动力学（表1）。

图7 Biacore检测一系列抗体和新冠RBD之间的亲和力

结合假病毒实验和细胞实验，他们发现扁豆(Lens culinaris)中提取的凝集素对一系列新冠病毒变异株均具有抑制作用，并借助Biacore开展竞争实验，直接验证了扁豆凝集素的抗病毒机制。从图8可以看到，不含扁豆凝集素的病毒S蛋白与固定在芯片上的ACE2有明显的结合信号（黑线），但将S蛋白与不同浓度的扁豆凝集素混合后进样，随着扁豆凝集素浓度的提高，S蛋白与ACE2的结合受到明显抑制。这一研究是人类第一次发现并揭示扁豆凝集素的抗病毒作用，对未来新的抗病毒策略的开发具有重要的启示作用。

图8 Biacore直接验证扁豆凝集素对ACE2-S蛋白的竞争抑制作用

可以看到中检院的科研人员在新冠病毒研究方面做了大量的工作，从跨种传播机制的探讨，到治疗性单克隆抗体的发现和优化，以及新型的植物蛋白抗病毒作用的探索，其中Biacore的身影可谓无处不在，提供了大量的核心数据。

其实中检院利用Biacore所做的研究工作远不止于此，小编还收集了在结构生物学领域，疫苗质控方法的建立，以及小分子研究中的精彩成果，我们将在下周同一时间与大家分享，敬请期待！