Biacore引领抗体设计新风尚-pH敏感性改造

话接上回，基于抗体的抗癌疗法旨在靶向肿瘤细胞上存在的抗原。然而，在大多数情况下，癌细胞过表达的靶抗原在正常组织中也存在低表达。在这些情况下，为了降低抗体毒性，一种策略是利用肿瘤细胞相对于正常细胞更高的抗原密度。这种方法需要调节抗体-抗原亲和力。（☞ 号外！号外！Biacore爆出CAR-T设计惊天大秘密！）当然我们也知道只有当肿瘤细胞及其周围基质上存在显著的抗原过表达时，才能应用基于亲和力的方法，于是科学家们逐渐开始使用另一种策略。

厌氧糖酵解效应

AI从头设计酸性pH选择性抗体

作者首先将双pH组氨酸扫描数据应用于抗体和蛋白质治疗辅助设计 (ADAPT) 平台，该平台多用于抗体-抗原亲和力成熟。然后在该计算平台上提高bH1-Her2复合物对酸性pH结合条件的结合选择性。设计结果首先在两个pH下以Fab形式通过Biacore进行与靶点的结合验证。

测试亲本和选定的bH1-Fab变体在生理pH值为7.4和pH 5.0时通过表面等离子共振 (SPR) 与重组Her2胞外域蛋白的结合，其中Fab样品流过固定在传感器芯片表面的抗原外域。有趣的是，由于较慢的结合速率和较快的解离速率，亲本bH1-Fab在酸性pH (KD = 13 ± 4 nM) 下与生理pH (KD = 3 ± 1 nM) 下的亲和力相比弱了约4倍。相比之下，作者通过设计表达出来的变体bH1-P5具有突变为组氨酸的H-R58氨基酸残基，在酸性pH (KD = 98 ± 30 nM) 下比生理pH (KD = 310 ± 8 nM) 下显示出更强的抗原结合性。说明作者在pH依赖方向上的设计获得了成功，这种趋势在图1的等亲和力图中更加直观。

表1：Fab与重组人Her2胞外域结合的SPR数据

因为表1的SPR结合分析是在25°C下进行的，所以作者在37°C下重复了实验并获得了相似的趋势（表2），具有几乎相同的解离平衡常数和略高的结合速率常数。

表2：37°C下bH1-Fab的选定单点组氨酸突变体的SPR结合数据

基于单点突变体的SPR数据，选择了三个设计bH1变体bH1-P5、-P7和-P8用于双突变体bH1-P5P7 (H-R58H, L-R30aH) 和bH1-P5P8 (H-R58H, L-S30bH) 的生产。两个双突变体在酸性pH条件下的抗原结合强度是生理pH条件下的6倍。这是由于生理pH下比酸性pH下更快的解离，与亲本形成鲜明对比，这在等亲和图中也很明显（图1）。通过比较变体bH1-P5P8与亲本bH1-Fab，我们发现酸性环境中的抗原结合仅略微减弱（KD分别为50 ± 20 nM和13 ± 4 nM），而生理环境中的结合亲和力有被削弱了2个数量级（KD分别为290 ± 50 nM 和3 ± 1 nM）。这也很容易通过图2中显示的相应SPR传感图直观的看到。

图1：Biacore绘制的等亲和图。酸性pH数据用红色符号绘制，生理pH数据用黑色符号绘制。箭头指向表示等亲和图上的数据点从生理环境移动到酸性环境发生的偏移

图2：抗原与所选变体的SPR传感器图

表3

随后在细胞表面表达的完整Her2上进行测试。最终在肿瘤球体模型中证明了该抗体的活性。抗体在pH 6.4抑制球体生长，但在pH 7.4没有观察到作用。

总结

这篇应用文献中的改造趋势与再循环抗体改造原理类似但是方向完全相反，酸性pH值是由于肿瘤细胞利用糖酵解途径，产生乳酸形成的。酸性pH环境会形成抑制性免疫微环境，帮助肿瘤细胞产生免疫逃逸，同时也会影响经典抗体的生物利用度。但是科学家也是利用酸性pH开发选择性抗体及CAR-T细胞治疗技术，这种pH敏感性抗体在酸性条件下对抗原亲和力高，这样就提高了抗体的组织分布特异性，降低抗体在正常组织中的分布和副作用。

图3：Dual依序进行两种溶液进样，在溶液A和溶液B之间没有清洗步骤

最新发布的Biacore 1系列升级了Dual inject功能，可以任意搭配不同盐度或pH的结合buffer及解离buffer，让你在完美保持连续流的状态下更好地观察不同pH下抗体的结合解离变化，选择出真正具有pH敏感度的抗体。数据经过拟合分析，将微小的差异量化，让每一个微小的提升积少成多，从量变达到质变。Dual设计初衷用于研究蛋白质与配体在不同缓冲液中解离的差异。另一个用途是就是研究类似抗体分子的pH值依赖性，以模拟体内pH值对抗体药物偶联物与靶受体解离的影响。

图4：通过ABA可在同一循环内按以下顺序将两种不同的溶液连续进样到传感器表面：溶液A、溶液B，然后溶液A。

另外一种ABA模式可以为每个样品创建临时缓冲环境，在微孔板上进行缓冲液筛选。ABA这种进样方式可以用于竞争测定法。使用ABA采集的数据可以在 Biacore Insight 分析软件中进行动力学模型拟合。

图5：通过Poly连续进样三到五种溶液（溶液A到溶液E），中间没有清洗步骤，可研究多重复合物的形成

Biacore 1系列内置了全新的进样模式—Poly。通过 Poly，提供了研究蛋白质复合物的新可能性，包括那些由多价分子如PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）及其结合伴侣形成的复合物。Poly可以连续进样三到五种溶液，中间没有清洗步骤。