药物研发加速器：Biacore助力STING抑制剂的发现

近年来，全球各大药企，如安进、百时美施贵宝、礼来、默克、诺华、恒瑞等均布局一系列管线产品占有肿瘤免疫市场。从2011年上市的CTLA-4抗体到2014年上市的PD-1抗体，不少靶向免疫检查点的单抗已经成为肿瘤治疗与市场的“重磅炸弹”。

肿瘤免疫领域的靶点纷纷成为诸多药企追踪的“明星靶点”，而STING（干扰素基因刺激蛋白）靶点便是其中之一。全球各大药企均已加入STING赛道。2021年4月，成都先导药物开发股份有限公司开发的注射用HG381的临床试验申请获得国家药品监督管理局批准，临床拟用于治疗晚期实体瘤。根据公开信息显示，HG381是首个在中国自主研发获批开展临床研究的STING激动剂。

固有免疫系统是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线，能激活机体的适应性免疫共同清除入侵的病原体，维持机体的稳态。胞浆DNA 介导的 cGAS-STING 固有免疫信号通路的激活，在机体抵抗 DNA 病毒和逆转录病毒等多种病原体入侵中发挥着重要的作用。

然而越来越多的研究发现，STING 信号通路的异常激活能诱发无菌性炎症疾病包括自身免疫疾病、神经退行性疾病、代谢紊乱疾病和癌症的发生和发展。因此，开发靶向 STING 蛋白的小分子抑制剂或激动剂，具有重要的基础研究意义和潜在的临床应用价值 。

近期，权威期刊《美国科学院院报》（PNAS）在线发表了中国药科大学王琛教授团队题为 STING inhibitors target the cyclic dinucleotide binding pocket 的最新科研成果。该团队通过靶向STING蛋白的化合物筛选和生物活性评价发现，小分子SN-011具有强效的靶向STING信号通路的抑制作用，并且特异性强、安全性好，是极具吸引力的先导化合物，可用于开发治疗 STING 驱动的自身免疫和炎症疾病的药物。

在该研究中Biacore同样发挥了重要作用，证明小分子SN-011特异性结合STING蛋白，并且结合在STING蛋白与其内源性配体分子2’3’-cGAMP结合的口袋内，将 STING 二聚体锁定在开放、无活性的构象中，从而起到抑制STING信号通路的作用。

首先，研究人员通过虚拟筛选的方法（in silico docking screening），从含有570,642个化合物的库中获得了11个可能与STING蛋白C端功能域（CTD）结合的化合物，并对其生物活性进行评价，发现4个化合物具有显著的抑制作用，其中SN-001是最具活性的化合物。为了获得更有效的抑制剂，研究人员使用七个 SN-001 类似物（SN-005 至 SN-011）对 SN-001 进行了构效关系 (SAR) 研究，并对其生物活性进行评估。结果显示，SN-011是STING信号通路的强效抑制剂。

那么，SN-011是否直接与STING蛋白互作？结合在STING蛋白上的关键氨基酸位点又是哪个呢？

研究人员使用Biacore T200，将STING的C端功能域（CTD）固定在CM5芯片上，化合物SN-011作为流动相流经芯片表面，检测其亲和力KD。结果显示，化合物SN-011与STING蛋白的C端功能域（CTD）结合，并且亲和力为4.03 nM，高于天然配体2’3’-cGAMP与STING蛋白的亲和力（KD = 9.23 nM）。而阴性对照SN-100不与STING蛋白的C端功能域（CTD）结合。通过结构分析发现，STING 二聚体界面中的Ser243是SN-011的重要结合位点，将STING蛋白第243位的Ser突变为Ala后STING（S243A），化合物SN-011与STING（S243A）结合明显变弱（KD = 176 nM），表明S243是化合物SN-011结合的关键氨基酸位点。

为进一步证明化合物SN-011的功能，研究人员在STING相关疾病的细胞模型和动物模型中，证明SN-011对于STING相关疾病的潜在疗效。婴儿期发生的 STING 相关的血管样病变 (STING-associated vasculopathy with onset in infancy, SAVI)是由于编码 STING 蛋白的基因 TMEM173突变导致STING蛋白异常激活引起的罕见自身免疫疾病。在过表达STING相关的突变体的细胞内，SN-011能显著抑制下游过度激活的免疫和炎症细胞因子。在Aicardi-Goutieres syndrome的小鼠疾病模型（Trex1-/-）中，SN-011能显著改善小鼠多组织器官的免疫损伤，且延长疾病小鼠的生存时间。

至此，科研人员发现了STING 特异性拮抗剂 SN-011作为一种有吸引力的先导化合物，可用于开发治疗 STING 驱动的自身免疫和炎症疾病的药物，为治疗STING 介导的临床疾病铺平了道路。

回顾整篇文章（图3），研究人员在通过虚拟筛选的方法（in silico docking screening），从含有570,642个化合物的库中获得了11个可能与STING蛋白C端功能域（CTD）结合的化合物。

通过RT-PCR、Western blots和Confocal，并对其生物活性进行评价，发现4个化合物（SN-001到SN-004）具有显著的抑制作用，其中SN-001是最具活性的化合物。使用Ni2+-NTA和Superdex 200进行STING蛋白纯化，进一步使用Biacore T200表征了SN-011与STING蛋白的结合亲和力。

通过结构分析发现，STING 二聚体界面中的Ser243是SN-011的重要结合位点，并通过Biacore T200得以证明。

通过检测小分子SN-011在STING相关疾病的细胞模型和动物模型中的作用，以及细胞毒性和特异性检测，证明SN-011可用于开发治疗 STING 驱动的自身免疫和炎症疾病的药物。

该研究中，对于蛋白STING与小分子SN-011的相互作用检测，难点在于：小分子SN-011与STING蛋白结合产生的信号只有几个RU（RMS），这已经到达了其他检测技术的灵敏度极限，因此其他检测方法基本束手无策。而Biacore T200具有高达pg级别的超高灵敏度0.03 RU (RMS)，高于同类技术2个数量级以上，能够对于小分子的检测无分子量下限，从而确保了低信号的结合也能精确检测。

自 1990 年上市至今，Biacore作为唯一被中美日等多国药典收录的分子互作检测“金标准”，已广泛应用到基础科研与药物开发的多个领域。截至目前，借助 Biacore 累计发表的文章已突破 55,000 篇，超过 80% 的已上市的抗体药物的研发、申报、生产过程中也均有 Biacore 的身影。相信有了Biacore助力“产学研”，未来一定会有越来越多的中和抗体药物从研发走向上市。