肝细胞癌治疗的新曙光：Biacore助力GPC3/CD47双抗开发

CD47作为新一代肿瘤免疫治疗的靶点，被业内认为是继PD-1/PD-L1之后攻克癌症的重磅“希望”，热度不断提升。基于CD47的双抗也是异军突起，持续引发关注。宜明昂科自主研发的两个基于CD47的双抗IMM0306（CD47/CD20双抗）和IMM2902（CD47/Her2双抗）均已获批临床；2020年，信达生物开发的新型抗CD47/PD-L1双特异性抗体IBI-322在中国获得临床试验默示许可；就在这个月，CDE官网显示百奥泰的PD-L1/CD47双抗BAT7104也已申报临床。

今天小编就带大家看看基于CD47的双抗在肝细胞癌研究中的应用进展。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC) 是全球范围内第六大常见癌症，为癌症相关死亡原因的第四位。然而目前在临床上的治疗手段非常有限，以肿瘤抗原靶向抗体和免疫调节抗体为基础的免疫治疗代表着肝细胞癌治疗的新方向。

GPC3是肝癌特异性相关抗原，其特点是在肝癌组织中高表达，而在正常肝组织不表达或低表达，然而目前以GPC3为靶点的抗体临床效果有限。肿瘤细胞上高表达的CD47与巨噬细胞表面受体SIRPα结合，传递出“别吃我”的信号，从而屏蔽巨噬细胞的吞噬功能。但是由于正常细胞，特别是红细胞（RBCs）也会表达CD47，CD47治疗药物杀伤肿瘤细胞的同时，可能会误伤红细胞，引发红细胞凝集反应并造成严重的副作用。

2021年，北京师范大学，北京生命科学研究所，北京大学和清华大学联合在《Molecular Therapy》上发表文章，介绍了一种同时靶向GPC3和CD47的双特异性抗体药物，研究结果表明GPC3/CD47双抗在安全性、半衰期和抗肿瘤活性上都比单克隆抗体具有明显优势，有望成为下一代治疗肝细胞癌的药物。

研究人员首先通过筛选得到了靶向GPC3的单抗GC33和靶向CD47的单抗BC18。用Biacore对这两个单抗与靶点的亲和力进行了表征（图1）。Biacore结果显示，这两个抗体与各自靶点的亲和力均在nM级别。

在这两个单抗的基础上，研究人员通过对GC33和BC18单抗进行改造得到了GPC3/ CD47双抗，以及两个对照的双抗GPC3/Ctrl和Ctrl /CD47（图2A）。作者进一步利用Biacore对得到的双抗与靶点的结合进行了直观的表征。将GPC3蛋白固定在CM5芯片上，GPC3/ CD47双抗进样得到了一个明显的结合信号R1，再进样CD47，可以观察到结合信号R2，说明GPC3/ CD47双抗保留了结合两个靶点的能力（图2B）。

同样通过Biacore实验可以清楚地看到，作为对照，无论是CD47和GPC3的单克隆抗体，还是Ctrl/CD47和GPC3/Ctrl双抗，利用Anti-human抗体捕获到芯片上之后，都只有结合单个靶点（CD47或者GPC3）的活性（图3）。

在分子层面上确认了抗体与靶点的结合之后，研究人员通过一系列的细胞实验和动物实验，证实了与单克隆抗体CD47相比，CD47的双抗形式，无论是GPC3/ CD47，还是Ctrl/CD47，都具有更高的安全性，不会引发明显的血液毒性，也具有明显更长的半衰期。

随后的动物实验也表明，GPC3/ CD47双抗具有更好的抗肿瘤活性，这种更高的抗肿瘤活性是否与Fc介导的ADCC/ADCP免疫治疗效应相关呢？

研究人员构建了GPC3/ CD47双抗的突变体GPC3/ CD47-DAND，这种突变体将其Fc段两个关键的氨基酸进行突变（D265A和N297G），从Biacore的验证结果可以看出，突变之后的GPC3/ CD47-DAND无法与Fc受体结合（图4）。动物实验也证实了这种突变体失去了抗肿瘤的活性，说明Fc介导的功能效应是GPC3/ CD47双抗发挥抗肿瘤作用所必须的。

纵观全文（图5），研究人员构建得到GPC3/ CD47双抗以及作为对照的Ctrl/CD47和GPC3/Ctrl双抗后，首先利用Biacore和FACS技术从分子和细胞层面上对抗体的结合活性进行了表征。在对双抗的毒性进行研究时，通过红细胞凝集实验和动物实验（构建表达hCD47/hSIRPα的人源化小鼠）发现CD47的双抗（包括GPC3/ CD47和Ctrl/CD47）不会引发明显的血液毒性。药代动力学实验表明构建的双抗GPC3/ CD47和Ctrl/CD47的半衰期明显高于CD47单克隆抗体。在HCC疾病的细胞模型和动物模型中证实了GPC3/ CD47双抗具有更好的抗肿瘤活性，并且与巨噬细胞和中性粒细胞参与的，Fc介导ADCC/ADCP途径相关。

在整篇文章中，Biacore在定量表征抗体和靶点亲和力，定性确认双抗结合两个靶点的活性，以及抗体与Fc受体的检测方面提供了丰富的数据。

该研究中得到的GPC3/ CD47双抗不仅具有更长的半衰期和更高的安全性，还具有明显提升的抗肿瘤活性，甚至比同时使用GPC3单抗和CD47单抗治疗的效果更好，因为GPC3/ CD47双抗的形式不仅解除了巨噬细胞抑制信号，同时Fc介导的ADCC/ADCP途径提高了肿瘤免疫治疗效应。该研究阐明了一种通过增强天然免疫来改善肝癌治疗的策略，为未来免疫创新疗法的发展提供了新的思路。

Biacore作为中美日三国药典收录的分子互作技术，在双特异性抗体的研发和质控领域有着大量的应用，在双特异性抗体的结合活性、活性浓度、热稳定性等检测和研究中发挥了巨大作用。Biacore设备符合GxP和21 CFR Part 11的合规要求，具有高准确性、高灵敏度、高重复性，在双特异性抗体药物研发和质控中引领着潮流。