二甲双胍靶点终破解，Biacore技术显神威

二甲双胍（化学式C4H11N5，分子量129.164）是一种天然化合物的衍生物，是治疗二型糖尿病最常用药物。近年来，人们发现二甲双胍有各种神奇作用，除了降低血糖，它还有潜在的抵抗糖尿病所引起的多种癌症的效果等；对于健康人群，二甲双胍也很可能有抵抗衰老、延长寿命的作用。然而，二甲双胍的作用是有局限性的，例如，它只能作用于肝脏、肠道等少数几个组织，对脂肪组织则束手无策。因此，如果能设计出专一性靶向脂肪组织里的二甲双胍靶点的药物，一定能为日益严重的营养过剩等各种代谢性疾病的治疗带来福音。

AMPK（AMP-activated protein kinase）是多种代谢途径的主要参与者。先前的研究发现，二甲双胍的疾病治疗作用至少部分与导致AMPK激活有关。然而，二甲双胍激活AMPK的机制目前尚不清楚，甚至是有争议的。2014年发表的一项研究表明，二甲双胍治疗增加了细胞内的AMP水平，但后来的一些研究在用二甲双胍处理的细胞系中并未检测到AMP水平的变化。

厦门大学生命科学学院林圣彩院士团队长期致力于代谢稳态和代谢疾病发生机制的研究，2016年10月11日，该团队在Cell Metabolism上发表了题为“Metformin Activates AMPK through the Lysosomal Pathway”的论文，揭开了二甲双胍降血糖作用背后的机制，并且找到了该药抗癌作用相关的新线索。2022年2月24日，林圣彩院士团队和厦门大学邓贤明教授团队合作，通过“钩钓”式的化学探针，找到了百年神药二甲双胍的分子靶点，即二甲双胍发挥其神奇作用的蛋白——PEN2（γ-secretase的亚基），并搞清了它工作的具体方式。这一历时七年的研究成果发表在国际顶级学术刊物Nature杂志上。

在该项研究中，邓贤明教授团队首先通过一系列摸索，突破了多个化学合成上的难题，合成了二甲双胍的化学探针（Met-P1）。将生物素标记的二甲双胍与溶酶体的裂解液孵育，使用NeutrAvidin beads进行pull down后进行质谱分析（图1）。从367个溶酶体上的蛋白中，鉴定出113个蛋白可以被Met-P1探针pull down。随后，研究者使用shRNA silencing逐一在细胞中knock down这些蛋白，最终找到了一个名为PEN2的蛋白，能够介导二甲双胍对AMPK的激活。共聚焦显微镜STORM，透射电镜数据也显示一部分（大约40%）的PEN2定位于溶酶体。

随后，研究者进一步在分子层面研究了PEN2蛋白与二甲双胍的结合。首先通过DSC和ITC确认了二甲双胍与PEN2蛋白的结合（图2a，b）。然后使用SPR定量研究了二甲双胍与PEN2蛋白的相互作用（图2f）。

SPR实验使用Biacore T200完成，将PEN2或双突变PEN2蛋白使用pH4.0醋酸钠溶液稀释后，分别偶联到CM5芯片的两个通道，相邻的通道作为参比。将二甲双胍母液稀释成0.05，0.78，1.56，3.125，6.25 μM浓度梯度进行进样，使用10mM Glycine pH 2.0进行芯片再生。Biacore结果显示二甲双胍与PEN2蛋白的亲和力KD为0.15 μM（ka=2.8E+3 M-1S-1，kd=4.2E-4 S-1），此数值在动物或病人常规用药后细胞内二甲双胍浓度范围内。计算模型显示，二甲双胍与PEN2的F35和E40残基形成直接互作（图3e），而将F35与E40突变为丙氨酸后（PEN-2A）阻断了与二甲双胍的结合，Biacore结果显示PEN-2A不结合二甲双胍（图3f）。

作者继续研究PEN2的下游通路。PEN2与溶酶体裂解液蛋白孵育免疫共沉淀后进行质谱分析。总共1881个蛋白能结合PEN2，其中889个经二甲双胍处理后有明显变化。在889个蛋白中，123个为溶酶体内蛋白。经过一系列的in cells和in vitro的co-IP实验，最终找到ATP6AP1（v-ATPase的辅助因子），能依赖于二甲双胍与PEN2相互作用。后续的实验进一步表明，PEN2就是二甲双胍启动溶酶体途径激活AMPK的前提，而敲除了PEN2，二甲双胍不但不能激活AMPK，它对于降低脂肪肝、缓解高血糖、延长寿命等诸多效果就都不存在了。

在此文章中，作者鉴定出PEN2是二甲双胍的靶点。高浓度的二甲双胍可以通过提高AMP浓度来激活AMPK。而经低浓度的二甲双胍刺激后，PEN2结合ATP6AP1，通过不提升AMP与ADP的方式来抑制v-ATPase的活性，随后激活溶酶体AMPK。这样PEN2-ATP6AP1线路组成了信号分流，与溶酶体v-ATPase-AXIN-AMPK线路相交，使低浓度的二甲双胍能利用不依赖AMP的AMPK激活信号通路，此通路也能由葡萄糖饥饿激活。作者证实PEN2-ATP6AP1通路不参与低葡萄糖激活AMPK，说明PEN2-ATP6AP1线路是通往v-ATPase复合体的一条平行路线。这样，两条线路PEN2-ATP6AP1和aldolase-TRPV，分别感知二甲双胍的存在和葡萄糖饥饿，通过影响v-ATPase控制AMPK的激活（图4）。

如专家点评时所说，“在目前，解析类似于二甲双胍这样的小分子和蛋白质的相互作用，仍是一个很前沿，或者说是很不成熟的领域。对于这种极高的“假阳性”，目前并没有任何手段加以避免，只能说是小分子和蛋白质结合的本质就是如此。因此，唯一的方法只能是不厌其烦地逐一筛选，而这需要的是热爱和执着，以及对小分子“见微知著”的坚定信念。” 而在此过程中，使用ITC和SPR等分子互作手段，对于蛋白-小分子的互作加以验证与定量，以及通过分子模拟，突变+互作实验，对小分子的作用位点加以确认，显得尤为重要。