FDA：基于SPR建立流感中和抗体筛选的方法

流感的季节性反复使人们更加关注为重症患者输注异源特异性抗体的潜在益处。2023年美国FDA生物制品评价与研究中心 (Center for Biologics Evaluation and Research, CBER) 发表了题为“Method for screening inﬂuenza neutralizing antibodies in crude human plasma and its derivatives using SPR”的文章，介绍了采用Biacore评估人血浆样品和IGIV产品（intravenous immunoglobulin，静脉注射人免疫球蛋白）中特异性抗流感病毒抗体的方法（图1）。

图1：FDA发表文章截图

FDA指出SPR提供了一种高通量、快速、准确、可靠的方法，可以替代传统手段如HAI血凝实验和微量中和实验，用于从大量供体血浆中筛选高中和活性的样本来生产高效的免疫球蛋白。下面我们就来详细看看FDA是如何用Biacore开发这一新方法的。

01

结合特异性与芯片表面的稳定性

研究人员在SA芯片的Fc1上固定α2,8唾液酸受体类似物作为阴性对照，Fc2上固定Glycan 3′SLN-PAA-biotin （α2,3唾液酸受体类似物，特异性结合H1凝集素），Fc3上固定Glycan 3′SLN-PAA-biotin （α2,6唾液酸受体类似物，特异性结合H5凝集素）。

Biacore实验结果验证了这种结合的特异性，如图2a所示，NR-44074（H1亚型凝集素）特异性结合于Fc2的α2,6唾液酸受体类似物，与其他通道固定的唾液酸受体类似物没有结合 (α2,3/α2,8) ，并且结合的响应值与NR-44074的浓度呈线性相关（图2b）。

图2：NR-44074特异性结合α2,6唾液酸受体

此外研究人员通过多次结合/再生循环评估芯片表面的稳定性，结果显示结合响应值的差异性为0.2%（图3），表明这一实验方案是稳定可靠的。

图3：评估芯片表面稳定性

02

单克隆抗体和免疫血清抑制能力

研究人员将含有有效抗体的样品与H1凝集素孵育后上样，检测不同样品抑制H1凝集素与α2,6唾液酸受体结合的能力。

如图4a所示，纯化的小鼠腹水来源针对H1的单克隆抗体NR-28666按照1:8000稀释之后完全抑制了H1凝集素与α2,6唾液酸受体的结合（图4a，红色传感线）。使用感染H1N1的动物抗血清也得到了相似的结果（图4a，绿色传感线），只是抑制效率不如单克隆抗体。作为阴性对照的Anti-H5单克隆抗体2728未展现出这一抑制作用（图4a，黑色传感线）

实验中还测试了WHO作为参照的针对每年流行的流感亚型的兔抗血清，结果显示只有anti-H1-like A/California/07/2009的抗血清（图4b，红色传感线）表现出对A/California/07/2009 or A/California/04/2009 rHA结合的抑制，其他亚型的抗血清与H1凝集素预混后并未影响rHA的结合（图4b）。

图4：单克隆抗体和免疫血清抑制能力实验

03

人血浆样品的抑制能力

血浆样品按照1:1的比例与rHA预混后上样，通过与对照样品（未感染的正常人类血浆）比较用下降的信号值比例计算抑制效果。Biacore得到的结果与HAI血凝实验一致（图5b），HAI结果中显示含有大量特异性抗体的血浆样本在Biacore实验中几乎完全抑制了HA与受体的结合（图5a○），而中等滴度的血浆样本显示出对结合的部分抑制（图5a▲），含有微量抗体的样本抑制能力小于5%（图5a□）。后续使用病毒粒子替代rHA重复了该实验，也得到了同样的结果。

图5：血浆样品的Biacore抑制实验

04

抗体定量

研究人员采用标准曲线法测定样品中的流感中和抗体的含量。使用竞争法，将含有已知抗体浓度的标准品与rHA预混后上样，计算转换后得到抗体浓度与抑制效率的标准曲线（图6a）。SPR测得的抗体含量与传统HAI方法具有显著相关性（图6b）。

图6：Biacore竞争法检测抗体含量

05

不同IGIV产品中抗流感特异性抗体含量

采用建立的这种SPR方法筛选2009年H1N1大流行前后生产的IGIV产品中的anti-pdmH1N1抗体。图7b中的虚线表示单独进样rHA时与固定在芯片表面的α2,6唾液酸受体的结合，可以看到不同批次的IGIV产品对rHA与受体的结合都有不同程度的抑制，由此计算得到IC50值，这一结果与HAI的实验结果也具有很强的相关性（R2=0.989，图7a）。

图7：SPR方法评估不同IGIV产品中流感抗体的含量

06

全病毒实验

研究中使用B/Victoria/504/2000和A/California/04/2009 H1N1流感病毒的完整病毒颗粒重复了SPR实验。Biacore结果显示B/Victoria/504/2000和A/California/04/2009 H1N1病毒与α2,3及 α2,6受体均有结合，但显示出信号值和动力学速率的差异（图8a/b）。抑制实验中也表现出明显的浓度依赖的抑制作用（图8c/d）。

图8：流感病毒粒子的结合特异性及抑制实验

总结

Biacore作为一种高通量，全自动的互作分析设备，与传统的HAI血凝抑制试验相比，能够快速从大量血浆/血清捐献者样品或者IGIV产品中筛选出含有高中和活性抗体的样本。在流行病环境下，采集高免疫血浆用于治疗或预防重症是非常重要的应对策略。

FDA生物制品评价与研究中心基于Biacore所建立的这一评估流感病毒中和抗体效力的方法，与传统HAI的结果显著相关，Biacore的高数据质量和实验的稳定性保证了最终结果的可靠性。这也显示了收录于中美日三国药典的SPR技术在治疗性抗体药物研发中的巨大潜力。