“多”用途，“肽”给力——Biacore 在多肽药物开发中的应用

多肽通常指不超过 100 个氨基酸构成的肽链。多肽药物集合了化学药物和蛋白类药物的优点，如分子量小、免疫原性低、生物活性高等，成为 21 世纪极具发展前途的药物。

目前，已有多款多肽药物获批上市，如胰岛素、生长激素、依特卡肽等。Biacore 作为中美日药典收录的分子互作技术，已广泛应用于多肽药物的筛选、机理研究、长效化、免疫原性和质控放行等环节，为诸多多肽药物开发提供了关键数据。

Biacore 进行多肽药物筛选的原理主要基于动力学数据，其中 ka 反映药物与蛋白的结合快慢，kd 反映药物结合靶标的稳定性，KD 反映药物与蛋白的亲和强弱。Biacore 可以快速精准的对多肽分子进行筛选和排序，从中筛选出亲和力高、解离慢的进行进一步开发。

例如：

北京大学来鲁华教授课题组针对肿瘤坏死因子 TNF-α 进行了多肽设计计算，然后将 TNF-α 固定在传感芯片表面，基于 Biacore 完成了多肽的结合活性测定，最终筛选到了 TBHa31 这一高亲和多肽。

研究人员还基于 Biacore 设计完成了多肽的竞争实验，证实了 TBHa31 可以阻断 TNF-α 和 TNFR 的结合。作者还对 TNF-α 进行了部分位点突变，发现突变后亲和力有明显降低甚至消失，进一步证实 TBHa31 的结合靶点就是 TNF-α。

2019 年，华北理工大学附属医院利用 Biacore 技术完成了降糖多肽的筛选。前期研究发现胃泌酸调节素 OXM 是一个有降糖作用的 37 肽，但其半衰期太短。于是作者设计了一系列的 12 肽 GLP-1 激动剂接到 OXM 上，最终基于 Biacore 结果筛选到了 PP11 作为基础进行脂肪酸链修饰以延长半衰期，并取得了不错的临床效果。

肿瘤细胞表面特异性高表达的硫酸糖胺聚糖（GAG）与肿瘤细胞转移紧密相关。由神经降压素衍生的多肽家族 (NT4) 具有显著的抑制肿瘤生长效果。细胞影像显示 NT4 多肽能够结合于肿瘤细胞表面，暗示 NT4 作用机制可能与 NT4-GAG 之间的相互作用有关。

为了阐明 NT4 的作用机制，研究人员将 NT4 多肽固定到芯片表面，不同类型的 GAG 聚糖（肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素）依次流过芯片表面进行亲和力测定。

Biacore 结果表明肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素均能与 NT4 直接相互作用，并且亲和力达到 nM 级别，提示 NT4 多肽具有很好的药物开发潜力。同时 NT4 与不同 GAG 之间结合的亲和力相差 1-2 个数量级，具有显著的选择性，这可能是 NT4 针对不同肿瘤治疗效果差异的分子基础。

结合细胞实验数据，研究人员比较了 NT4 对肿瘤细胞的抑制效果。NT4 与 GAG 的亲和力越高，抑制效果越好，当亲和力低至 10-8M 后，无抑制效果。

这篇文章中，Biacore 提供了直接的、定量的分子水平相互作用数据，帮助科研人员确证相互作用的发生机制和对象，与细胞实验结果具有很好的一致性。所以 Biacore 可以作为细胞实验前的高通量药物筛选工具，无需细胞培养，节省大量的时间人力成本。

蛇毒含有丰富的活性肽, 具有抗炎和免疫调节作用，但其抗炎活性成分及作用机理尚未明确。第二军医大学通过噬菌体展示技术从蛇毒中筛选得到了 Hydrostatin-SN1 这一天然多肽，采用 Biacore 阐明了该多肽能够特异性地结合 TNFR1（KD = 32μM），且 Hydrostatin-SN1 能够剂量依赖性阻断 TNF-α 与该受体的结合，从而发挥抗炎作用。

在已上市的多肽药物中，胰岛素和胰岛素类似物占有举足轻重的地位。胰岛素的好坏很大程度上取决于其与胰岛素受体的结合活性，而胰岛素疗效持续的时间长短则依赖于其在受体上解离快慢，因此，精确的表征不同胰岛素候选药物与受体结合的解离速率常数 kd，在胰岛素类药物研发的过程中至关重要。而这正是 Biacore 无可替代的优势所在。

目前，赛诺菲、诺和诺德、甘李、通化东宝等国内外胰岛素生产企业巨头纷纷采用 Biacore 进行胰岛素类似物的开发和质控，涵盖了胰岛素、德谷胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素等从第一代到第四代全部的胰岛素产品。

半衰期短是多肽药物面临的一大痛点。同济大学开发了一种治疗糖尿病的新型多肽，这种经过改造的 GLP-1 类似物能高亲和地结合白蛋白，免受肾脏滤过和蛋白酶降解，从而有效延长了药物在体内的半衰期。

该设计是在 GLP-1 上通过一个可被凝血酶切割的 linker 连接了由 39 个氨基酸组成的白蛋白结合域，而延长半衰期的关键就是提高多肽与白蛋白之间的亲和力。在此过程中，研究人员用 Biacore 验证了其构建的 XTS1/2 与不同种属的白蛋白之间的亲和力。

结果显示 XTS1 与白蛋白的亲和力高于 XTS2，预测 XTS1 在体内也有更长的存留时间。后续的动物实验也表明，XTS1 比利拉鲁肽有更好的结果。

除了利用与白蛋白的结合延长半衰期外，PEG 化也是一种经典的延长多肽半衰期的方法。但 PEG 的分子量比较高，多肽在 PEG 化后有可能影响其与相应受体的结合。因此，准确检测多肽 PEG 化前后与受体结合活性的变化对于其药效的发挥至关重要。

目前，辉瑞和金赛药业在长效生长激素的开发中，也都使用了 Biacore 去检测 PEG 化前后对生长激素与受体结合的影响。并且该方法已经成为行业内的放行标准，用于不同 PEG 化多肽产品的批次放行。

药物在体内会引起免疫应答，轻则中和药效，重则引起不良反应。免疫原性涉及药物的安全性和有效性，因此 FDA、EMA 等法规均将药物免疫原性列为强制性要求的检测项目。免疫原性包括抗药抗体 (ADA) 的筛选、验证、分型与中和活性检测。

• 在 2020 中国药典中，已将 Biacore 基于的 SPR 技术列为了免疫原性检测技术。
• 在 FDA 免疫原性指导原则中，将 SPR 技术与 ELISA、RIPA 一同列为了推荐的三种筛选方法。
• 在 EMA 对免疫原性检测的指导原则中，详细阐释了 SPR 技术进行免疫原性检测的优势：SPR 是一种实时检测技术，能够检测快速解离的抗药抗体，这些 ADA 可能无法被其他方法检测到，因为 ELISA 基于的桥联法可能会在检测过程中丢失信号，并且 Biacore 也比 ELISA 方法更耐受药物分子干扰。

因此，Amgen 公司的依特卡肽、赛诺菲公司的利西拉肽等上市多肽药物均基于 Biacore 完成了免疫原性数据申报，结果证实了 Biacore 抗药性抗体检出率高的优势。

综上所述：Biacore 作为分子互作检测金标准，已经广泛应用到多肽药物开发的很多环节，助力一大批多肽药物从研发走向上市。而作为唯一被中国、美国、日本药典收录的分子互作检测技术，Biacore 已广泛用于抗体、疫苗、多肽、小分子药物的研发、机理研究、免疫原性、质控放行等各环节，将继续为新药开发护航助力。

参考文献：

1. Angewandte Chemie, 2013, 52(42): 11059-11062.

2. Organic & biomolecular chemistry, 2019, 17(33): 7760-7771.

3. International journal of molecular sciences, 2016, 17(11): 1940.

4. Scientific reports, 2016, 6(1): 27174.

5. Scientific reports, 2016, 6(1): 1-13.

6. RSC Advances, 2019, 9(53): 30707-30714.

7. Xenobiotica, 2008, 38(10): 1340-1351.

8. Journal of immunological methods, 2017, 445: 37-44.

9. Diabetes care, 2013, 36(9): 2543-2550.