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询价做中药小分子绝对离不开它：Biacore助力甘草糖基转移酶研究
近日，来自于北京大学药学院叶敏教授的课题组在JACS发表了题为「Functional Characterization and Structural Basis of an Efficient Di‑C‑glycosyltransferase from Glycyrrhiza glabra」的文章，首次从药用植物甘草中发现了一种高效的二 C-糖基转移酶 GgCGT，该研究成果有助于开发高效的生物催化剂来合成具有药用潜力的 C-糖苷。
C-糖苷类化合物是一类重要的天然产物，具有很强的生物活性和抗胃肠道水解代谢的高稳定性。大多数 C-糖苷来源于植物，而从生物合成角度来讲，C-糖苷是由 C-糖基转移酶（CGTs）催化形成的。虽然 O-糖基转移酶（OGT）已被大家所熟知，但从植物中发现的 CGT 数量有限，人们对 CGTs 的催化机理知之甚少。
甘草是全世界广受欢迎的草药，它含有丰富的生物活性黄酮类和三萜苷类，尤其是黄酮类二碳糖苷类。虽然关于 OGT 已经有了很深入得研究，但目前为止还没有从甘草属植物中发现 CGTs。
本文的研究人员首先进行分子克隆及功能实验，以 CGT 基因作为研究对象。经序列分析，发现了目标基因并命名为 GgCGT。经过后续质谱与核磁鉴定，发现 GgCGT 是一种二 C-糖基转移酶。
其次，研究人员对 GgCGT 底物特异性进行研究，基于 UDP-Glc 通过酶活实验对 51 个化合物进行筛选，发现 GgCGT 可将其中六种底物完全转化为二 C-糖苷。采用核磁对产物结构进行鉴定，发现所有的 C-葡萄糖苷都含有一个 β-糖苷键。
进一步对 GgCGT 糖供体特性进行验证发现，GgCGT 比以往报道的 CGT 具有更高、更广泛的催化活性，尤其是在 CG 糖基化的第二步。
为了进一步研究 GgCGT 的催化机理，作者研究了 GgCGT/UDP-Glc、GgCGT/UDP-Gal、GgCGT/UDP/phloretin 和 GgCGT/UDP/nothofagin 的复合物晶体结构（如图 1，2 所示），GgCGT 成为了第一个具有晶体结构的双 C-糖基转移酶。
通过使用 Biacore 8K 生物分子相互作用分析系统，研究人员可以从分子层面入手，得到最直接的、无需标记的、定量的分子结合证据，证实 GgCGT 确实与 UDP Glc 有很强的结合，但与 UDP-Gal 却不结合（如图 3 所示），其中 GgCGT 与 UDP-Glc 结合亲和力（KD）为 15.5μM。 该结果也验证了此前作者通过其他方式对 GgCGT 糖供体选择性机制的推断。
研究人员不仅从药用植物甘草中发现了一种新的二 C-糖基转移酶 GgCGT，还分别用 UDP-Glc、UDPGal、UDP/phloretin 和 UDP/nothofagin 解析了其晶体结构。GgCGT 成为第一个具有晶体结构的二 C-糖基转移酶，以及第一个含有 UDP 糖和底物的复杂结构的 CGT。它能有效地催化至少 6 种含有氟丙酮单元的底物的双碳糖基化反应。该项研究对 C-糖基化转移酶的催化机制进行了深入的研究，这对于开发高效的生物催化剂来合成具有药用价值的 C-糖苷类化合物具有重要意义。
天然产物等小分子化合物与其受体或蛋白的结合研究，一直是中医药研究领域的热点。但小分子的分子量小，结合产生的信号很弱，往往只有几个或几十个 RMS 的信号，传统的方法很难检测蛋白-小分子间的互作。这就要求检测技术要有很高的灵敏度和分辨率去检测小分子与蛋白的互作。
在该项研究中，我们可以看到 GgCGT 与 UDP Glc 的结合信号只有 10RU (RMS) 左右，这已经达到了其他检测技术的灵敏度极限，根本无法进行检测。而 Biacore 8K 凭借着其超高的灵敏度（<0.02RU/RMS）, 能够精确的区分不同浓度间的结合信号，并且不同浓度间的结合传感图互不干扰，从而确保得到精确的结果和漂亮的数据。
除了本文提到的对小分子化合物与蛋白结合亲和力验证外， Biacore 以其超高灵敏度、无分子量检测限制的性能，以及独特「分子垂钓质谱联用」的功能，已经成为中药、天然产物、小分子化合物研究的必备工具。从作用机理到有效成分的发现与确认，Biacore 紧紧把握中药与天然产物研究痛点，帮助科学家们攻克了一个又一个难题，加速了科研成果的产出。