Biacore双标智测，疫苗安全更高效 | 思拓凡学堂中国官网

在疫苗生产过程中，病毒血凝素 (HA) 和宿主细胞蛋白 (HCP) 的准确量化对于确保疫苗的安全性和有效性至关重要。这两者的精准定量不仅可以控制疫苗质量，还可能进一步改善疫苗的免疫原性。

流感疫苗的效力与HA浓度相关，现有定量HA最常见的通过单径向免疫扩散法 (SRID) 来实现，另外，还可以通过酶联免疫吸附分析 (ELISA) 、神经氨酸酶 (NA) 活性分析、HPLC法、血凝分析法以及qPCR等方法实现。但是以上方法，存在精度和灵敏度较低、费时费力、速度慢及需要分析前制备样品等缺点。

而宿主细胞蛋白 (HCP) 的定量检测直接关系到疫苗的纯度和安全性。通常，有两种主要的方法用于定量检测HCP：Bradford蛋白测定法和酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 。

Bradford蛋白测定法：该方法基于染料与蛋白质结合的化学方法来测量总蛋白含量。然而，这种方法有其局限性：首先，其灵敏度较低，而且其检测范围也不够广泛，不能特异性地检测低于监管关键限制水平的HCP。

ELISA方法：这种方法使用针对细胞蛋白的多克隆抗体混合物来特异性地检测HCP。通过纯化的多克隆抗体，ELISA方法的灵敏度和特异性都有所提高。但是，其缺点也很明显，检测工作繁琐而耗时。

相比上述传统方法，使用Biacore技术来进行检测，可以显著改进HA和HCP的定量，通过直接测量分子间的相互作用来实现高灵敏度、高特异性和快速分析。Biacore检测不仅可以在短时间内提供准确的结果，而且能够检测到极低水平的HCP，从而确保疫苗的纯度和安全性。

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Biacore流感病毒定量检测

Biacore通过抑制实验来定量流感病毒，原理如图所示，首先，HA被固定在CM5芯片上，以红色圆圈表示。随后，病毒与固定浓度的血清混合并进样结合。在平衡状态下未与病毒结合的游离抗体与HA结合，产生响应。当样本中病毒浓度较低时 (A) ，抗体结合量高；而病毒浓度较高时 (B) ，结合水平则较低。

图1：Biacore流感病毒定量检测原理，A与B图分别表示病毒的浓度高低不同情况

如果您要开始实验，该如何做呢？实验步骤如下：

1

抗原固定：首先，通过氨基偶联，将重组HA抗原固定在CM5芯片上，响应值范围设置在4000到10000之间。

2

标准曲线：梯度稀释免疫过的羊血清标准品（含有针对特定流感菌株的抗体），设置进样400 s，该稀释倍数需要大约结合1000 RU的信号。在这样的稀释倍数下，标准曲线的动态范围会达到0.5-8 µg病毒/mL。在检测的开始、中间和结束各运行了三条校准曲线。

图2：Biacore流感病毒定量标准曲线传感图

3

样品分析：混合未知浓度的病毒样本与固定稀释度的抗流感血清，进样400 s。再生使用新鲜制备的50 mM HCl和0.05% Surfactant P20，时间设置为30 s。

为了获得准确的结果，可以稀释处理样本，以确保每个样本的至少两个稀释度落在标准曲线的范围内。

针对流感病毒定量实验开发时，Biacore方法也与SRID方法进行了对比。样品来自流感疫苗纯化过程中不同步骤的样本，包括从细胞培养上清液到最终过滤产品。为了进行比较，还使用SRID（单径向免疫扩散法）对相同样本进行了分析，从对比数据可以评估它们的准确性、一致性以及重复性。

表1：Biacore定量检测和SRID定量检测的结果

表2：比较Biacore定量检测和SRID定量检测

通过实验结果对比，Biacore检测具有更低的CV值（表1），说明其检测准确性高，重复性好，而且Biacore方法操作时间更短，灵敏度更高，其仅为定量限 (LOQ) 为1 μg/mL（表2）。由于Biacore可以在单个实验中同时测定三种病毒株，因此也提高了分析效率。这充分说明了，Biacore可以应用于精准定量检测HA。

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Biacore定量检测HCP的实验方法

Biacore通过直接结合检测HCP浓度，实验方法如下：

1

抗体固定：抗HCP抗体通过氨基偶联的方式固定在CM5芯片上。

2

使用MDCK细胞裂解液（可生产HCP抗体）建立标准曲线（图4），为了提高HCP检测的精确度，在检测的开始、中间和结束各运行了三条校准曲线。

图4：Biacore定量检测HCP的标准曲线传感图

图5：Biacore定量检测HCP的标准曲线，其浓度范围为0.25至32 µg/mL

3

样本进样：将待检测的工艺样本进样至HCP抗体固定的表面上，此时，样本中的特定HCP蛋白会与表面的抗体结合，从而产生结合响应值（如图5所示）。

同时，Biacore检测HCP方法开发时，也与经典的Bradford方法进行了对比。

对于工艺样本，通过Bradford蛋白检测法分析的样本显示的蛋白质浓度值通常比使用Biacore定量HCP检测法分析得到的值要高。这是因为Bradford方法检测的是样本中的总蛋白质含量，这包括病毒蛋白以及其他非HCP的蛋白质。然而，Biacore通过特异性结合，定量检测HCP浓度，具有较好的特异性。Bradford的定量限为60 µg/mL，而Biacore定量限 (LOQ) 为0.3 µg/mL（表3），Biacore检测法显示出了比Bradford蛋白检测法高100倍以上的灵敏度。有了这样的定量限，在工艺开发过程中可以量化更广泛范围的样本。

表3：Bradford蛋白检测法和Biacore定量HCP检测法的对比

总结

基于以上，小编总结了Biacore定量检测HA及HCP方法的优势：

HA检测

操作快，效率高：缩短了至少3倍的实验时间。

灵敏度高、准确度好：检测灵敏度高，CV值低。

定量限 (LOQ) ：Biacore生物传感器的定量限 (LOQ) 为1µg /mL。意味着Biacore可以检测到更低浓度的目标物质。

HCP检测

灵敏度高及定量范围广：更高的灵敏度，能够定量检测的样品范围更广，能够检测到更低浓度的HCP。

特异性强：Bradford法检测的是总蛋白质含量，而Biacore法则仅针对HCP，因此在需要特异性检测HCP的场合，Biacore法更为适用。

操作简便：两种方法各有特点，但Biacore法无需复杂的样品预处理过程，操作更为简便。

Biacore技术为流感疫苗中HA和HCPs的准确量化提供了强有力的工具。为疫苗的质量控制和生产过程带来了显著的改进。未来，Biacore技术在疫苗研发及生产将具有广阔的应用前景。