超慢解离如何解？Biacore Chaser Assay实操参考！

你是否遇到过这样“甜蜜的烦恼”：当药物-靶点或配体与受体的亲和力高到离谱，解离曲线几乎是一条直线，解离速率超出设备检测限，该如何破局？

今天带大家看看基因泰克、Sygnature Discovery等Biacore用户如何利用Chaser Assay检测超慢解离-超高亲和力互作。

基因泰克：Chaser Assay方法开发

基因泰克研究团队2018年发表的研究成果中，分别利用SA或NTA芯片构建Multi-point Chaser Assay或Single-Point Chaser with Affinity Capture实验方法，检测了多种激酶与29种小分子药物的解离速率和半衰期等数据【1】。其中Multi-point Chaser Assay对应不可逆的配体捕获方式，如SA芯片，当chaser慢解离时，需要用到多个通道。Single-Point Chaser with Affinity Capture对应可逆的配体捕获方式，一组通道即可完成一对或多对的Chaser Assay。

图1：Multi-point Chaser Assay检测方法

Chaser Assay中，首先在芯片表面构建配体-分析物复合物，在一定的解离时间后，分析物部分从芯片的配体上自发解离下来。此时引入竞争性结合分子chaser，获得chaser的结合信号(Rfree)。另外设置有配体，无分析物的通道，进样chaser，以获得chaser分子的Rmax。通过Rfree/Rmax VS解离时间，计算解离速率和半衰期等信息。

表1：使用Multi-point Chaser Assay检测小分子药物与靶点的解离速率

文中使用Multi-point Chaser Assay检测得到10^-7 S^-1的解离速率。

Sygnature Discovery：

IL-13 vs IL-13Ra2超慢解离

曲罗芦单抗（Tralokinumab）是一种专门针对IL-13细胞因子的全人源单抗，已证明在中重度特应性皮炎患者中的临床疗效和安全性。Biacore作为分子互作研究的“金标准”，被广泛应用在抗体-靶点、配体-受体的亲和力检测中。Sygnature Discovery的研究人员在使用Biacore检测IL-13与其受体IL-13Ra1，IL-13Ra2的亲和力时发现，IL-13Ra2的解离速率低于10^-6 S^-1（图2）。

图2：单循环动力学检测IL-13与其受体的结合

为了阐明曲罗芦单抗通过IL-13Ra2干扰IL-13内源性调节的程度，IL-13 vs IL-13Ra2的亲和力检测迫在眉睫。为此，参考基因泰克2018年发表的文章，作者进一步开发了一种简单而有效的办法：使用分析物本身或抗体作为chaser，引入芯片上配体分子的结合率（occupancy）概念，来计算超长时间（300000 s约3.5 d）的解离速率k_d，再将此解离速率代入到常规二元单循环动力学实验中，拟合得到k_a和K_D^【2】。

图3：Chaser assay+单循环动力学，解析超慢解离的亲和力/动力学

操作三步曲

1

饱和结合

首先，在Biacore芯片上固定配体，进样高浓度分析物以达到饱和。此时，芯片表面为“IL-13/IL-13Ra2”复合物。

2

引入chaser

在不同的解离时间点，进样高浓度chaser。在这个实验中，当IL-13被固定时，chaser是faster-dissociating IL-13R-competitive anti-IL-13 antibody，而当IL-13Ra2被固定时，由于没有合适的抗体，选择了分析物IL-13本身作为chaser！

想象一下，当芯片上的复合物中有分析物自然解离下来后，高浓度的chaser会结合在free的配体上，通过检测chaser的结合信号，即可反推得到此时芯片上配体分子的结合率（occupancy）。而当IL-13作为chaser的实验中，由于chaser本身是慢解离，则使用Biacore 8K的不同channel检测不同解离时间点的occupancy。

需要注意的是，为了排除长时间实验中配体活性变化的影响，chaser assay中，在第一步中设置只捕获配体的对照组以确定实时的配体结合能力。

Occupancy = 1 – 实验组chaser响应值/对照组chaser响应值

3

精准计算，获得真相

使用Prism软件绘制occupancy-time并拟合单一指数衰减获得速率常数k，即为解离速率k_d。将此解离速率代入到对应的二元单循环动力学实验中，拟合得到k_a和K_D。

通过Biacore Chaser Assay，研究人员成功测定IL-13与IL-13Ra2的解离速率低到10^-7 S^-1，亲和力高达38-148 fM。这一数据，为后续所有机制研究奠定了坚实的基础。相关研究于2023年发表。

Oncodesign Services-ZoBio：

候选化合物VS靶点超慢解离

Oncodesign Services-ZoBio团队的研究人员使用Biacore检测候选化合物分子MRTX1719与PRMT5酶的两种形式（PRMT5•SAM和PRMT5•MTA）的亲和力时，发现呈现出超慢解离。

为了明确MRTX1719与PRMT5的亲和力，研究人员引入了与MRTX1719竞争性结合PRMT5的小分子作为chaser，首先在芯片表面构建MRTX1719-PRMT5•SAM/PRMT5•MTA药物-靶点复合物作为三元实验组，PRMT5•SAM/PRMT5•MTA作为二元对照组，在不同时间进样chaser。可以看出，三元实验组通道上，随着解离时间的延长，MRTX1719解离量增加，chaser结合信号提高。通过计算芯片上配体的结合率，来获得解离速率和半衰期数据^【3】。

技术是设备的升华，设备是技术的基石！基于设备，又延展了设备检测能力边界的Chaser assay，离不开Biacore长时稳定的流路系统、稳定的芯片，和高灵敏度带来的低RU时依然稳定的信号。