揭开中药名方的神秘面纱，原来得靠它

利用分子对接鉴定了20组TNF通路相关的化合物-靶点后，作者利用Biacore 8K，将靶点蛋白（NFKB1，MMP-9，TNF-α， MAPK1）固定在CM5芯片表面，参比通道做活化和封闭处理，化合物作为分析物流过芯片表面，检测药物分子与靶点蛋白的动力学/亲和力。Biacore结果验证了分子对接结果中化合物-靶点的结合，其中formononetin与NFKB1的KD值为32.5 μM， isoliquiritin与TNF-α 或MMP-9的亲和力更强，KD 值分别为 3.6 μM和2.7 μM（图1）。Bavachin A和Ononin分别都与MAPK1有结合，Biacore结果发现Bavachin A与MAPK1的亲和力更强，达到6.05 μM（图1）。

图1 使用Biacore8K检测靶点与不同化合物的亲和力

借助于Biacore的实时检测，作者发现了liquiritin-MMP-9，Bavachin-MAPK1，liquiritin-MAPK1之间的动力学结合信息，发现liquiritin-MMP-9的解离最慢，Bavachin-MAPK1结合最快（图2），并提出动力学信息对先导化合物的发现具有重要意义。Biacore结果给出了药物-靶点结合的直接证据，也证明网络药理学虚拟筛选+分子对接方法的可行性。后续的细胞实验发现，与对照组相比，GBKC处理后细胞的TNF-α和IL-6的分泌水平明显下降。

图2 Biacore 8K 检测靶点与化合物的动力学结合过程

有证据表明NO和NOS（Nitric Oxide Synthase）是偏头痛的重要调节因子，这里作者也发现，给药组的NO表达水平和NOS酶活相较对照组明显下调。为了明确芎芍止痛处方中与NOS作用的关键化合物，作者使用Biacore T200 ，将NOS（Gly468–Leu616）偶联在CM5芯片上，用固定的8个浓度点（0-100 μM）依次流过15种血清检测到的化合物，筛选到两个有明显结合的化合物imperatorin (Imp)、xanthotoxin (Xan) ，并得到二者与NOS的亲和力分别是0.45 μM和0.69 μM（图3）。由此说明了Imp、Xan与NOS的直接结合，说明潜在的药物-靶点关系。

图3 Biacore筛选与靶点NOS结合的活性化合物

结合分子对接结果和急性肺损伤已报道的靶点，作者选择baicalin, wogonin和 baicalein三种化合物来做与靶点thrombin的体外结合验证。作者利用Biacore T200把thrombin固定在CM5芯片上，化合物作为分析物依次流过芯片表面。

图4 使用Biacore T200检测靶点thrombin与活性化合物的结合

动力学/亲和力结果发现，3种化合物表现出不同的结合模式，baicalein, wogonin与靶点的结合表现出典型的“快上快下”模式，用affinity模型拟合得到亲和力分别为11.92 μM和1.303 μM，而baicalin与靶点则表现出 “慢上慢下”，用kinetics拟合可得到结合速率和解离速率，并且得到的亲和力为1.146 μM（图4）。不同的结合模式，指示着活性分子与靶点复合物的稳定性，与药物的作用时间也有一定关系。Biacore实验中，不同的结合模式可使用对应的拟合模型得到相应的亲和力和动力学信息（图6），Biacore精准的动力学信息也为后续药物开发提供了重要意义。

图5 不同的结合模型对应的拟合模型

体外验证了靶点后，作者利用流式细胞术等方法在细胞水平做了信号通路的验证，结果证明清金化痰汤能抑制LPS激活的中性粒细胞中Src的磷酸化，抑制NETs的产生。