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Cell文章优选芯片：特异性捕获&牢固偶联兼得，且看Biacore NTA

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芯片是什么？

是提供金膜形成SPR（表面等离子共振）现象的关键角色，也是给配体分子栖身之所的大本营。

Biacore芯片如何抓住配体分子？

CM系列芯片可依靠羧基与伯氨等基团的共价结合，而捕获类芯片则借助捕获分子与配体分子的特异性结合。

特异性捕获&共价偶联兼得

有这样一种芯片，既可以共价结合又可以特异性捕获，它是谁呢？本期就带您认识具有双重身份的Biacore NTA芯片。

在金膜之上，NTA芯片的羧基化葡聚糖表面上修饰了NTA（次氮基三乙酸），NTA加Ni2+赋予其“捕获”功能，而未完全修饰的羧基基团则赋予其“偶联”的功能。使用“捕获”功能，可以得到特异性、可逆的捕获芯片，而同时使用“捕获”+“偶联”，就可以牢固地偶联His标签配体蛋白，且不需低pH缓冲液稀释。一张芯片，“双重”身份。
捕获：
NTA可通过螯合Ni2+，特异性捕获His标签蛋白，进一步检测此His标签蛋白与其他分子（无His标签）的动力学/亲和力检测等实验，实现可逆捕获检测实验。

 1 

串联法 (Tandem)

图1：抗原表位分析的实验方法示意图a夹心法、b预混法、c串联法

Biacore提供成熟的NTA芯片及配套试剂盒，包含了实验中会用到的螯合及再生试剂。控制软件中选择Kinetics/affinity using Sensor Chip NTA（Insight software of 1 series and 8 series & Control software of S200，X100及T200在Kinetics/affinity-芯片类型选择NTA即可）即可开展实验。具体实验流程包括：
  • General：芯片表面螯合Ni2+；
  • Capture：捕获His标签配体 (Ligand in running buffer) ；
  • Analyte：进样分析物，检测与配体的结合和解离过程。单循环实验中，可以在此步设置中一个循环设置多个浓度，直接得到浓度梯度的结果；
  • Regeneration：用EDTA洗去Ni2+及配体。
整个循环结束后，芯片回归到初始状态，可以用于其他His标签配体的检测。需要注意的是，分析物不可以有His标签，否则会直接结合在Ni2+上，影响检测结果。

熟悉His标签的老师可能会问：必须用EDTA再生么？当然不是。Kong et al. 使用NTA捕获法检测14–3-3ζ蛋白与化合物的结合时，化合物与靶点蛋白可以完全自发解离（快解离），因此不设置再生[1]；Lu et al. 使用NTA捕获法检测膜蛋白A2AR与化合物的结合，使用5 mM theophylline再生洗掉分析物而保留配体[2]。

捕获+偶联：
今年Cell杂志上发表的以Clp蛋白酶为靶点的新型抗结核病BacPROTACs研究成果，就是使用NTA芯片说明书中的Capture & Coupling的方法，检测ClpC3与天然抗生素或HBPs (Homo BacPROTACs) 的结合[3]。

图2：NTA芯片Capture & Coupling后，单循环检测ClpC3与药物的亲和力

“捕获”+“偶联”可使His标签配体蛋白稳定地共价结合在芯片。区别于CM系列芯片，NTA芯片并不通过静电吸附达到富集的目的，而是利用Ni2+与His标签的特异性结合，所以配体分子不需要使用低pH的醋酸钠缓冲液，用运行缓冲液稀释即可。

在Biacore控制软件中选择Immobilization-芯片类型选择NTA-add step-NTA Amine（Insight software of 1 series and 8 series， X100、T200及S200可在偶联方法中自定义偶联方法）即可开展实验。具体实验流程包括：

  • General：芯片表面螯合Ni2+；
  • Activation：EDC/NHS活化；
  • Capture：捕获His标签配体 (Ligand in running buffer) ，同时发生捕获和偶联。除了设置配体进样时间外，Biacore特有的Aim for target level模式，无需紧盯偶联信号，不用担心偶联多了、少了，只需要输入想要的偶联量，仪器自动调整进样时间，准确达到目标偶联量。精准偶联So Easy；
  • Deactivation 1：乙醇胺封闭；
  • Deactivation 2：用EDTA洗去Ni2+。

图3：NTA芯片捕获+直接偶联，target模式下自动完成目标偶联量

NTA-Amine实验结束后，His标签配体分子被牢牢地偶联在芯片上，等同于CM系列芯片的氨基偶联。后续的动力学/亲和力检测可按照实验需求，设置结合解离及再生步骤，再生并不会洗掉配体。值得注意的是，偶联完成后芯片上没有了Ni2+，所以分析物有无His标签都可检测。
串联法检测结果中，首先使A抗体尽量饱和抗原位点，若B抗体与A抗体结合在抗原不同表位上，则B抗体仍能结合芯片上的抗原，表现为蓝色曲线；若B抗体与A抗体结合抗原同一表位，则B抗体不能结合在抗原上，表现为红色曲线。

在夹心法和串联法中，也可以同时在第二步进有A抗体背景的B抗体（二者的混合物）3来规避掉A抗体与抗原的解离。

“芯”发现：CM系列芯片的多种玩法

“芯”发现：CM系列芯片的多种玩法

“芯”发现：CM系列芯片的多种玩法

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Biacore作为一种非标记分子互作技术，方便大家在开展实验的时候，无需样品前处理或者无需对样品进行任何标记。Biacore芯片巧妙的设计，可以利用样品上的各种基团，简单、便捷地固定样品。固定样品的方式非常多，其中最简单的便是氨基偶联法（直接法）。除了氨基偶联方法外，还可以通过醛基偶联、巯基偶联、马来亚酰胺偶联等方法，那么就让我们一起来盘点一下，各类偶联方法是如何实现对配体的固定吧！

氨基偶联

氨基偶联是将生物分子共价固定于传感芯片表面时使用最广泛的方法。CM3、CM4、CM5、CM7、C1、PEG芯片均可利用配体上的氨基来进行共价固定。氨基偶联原理如下图所示，传感芯片表面的羧基首先被EDC和NHS的混合物活化，从而生成具有反应活性的琥珀酰亚胺酯。然后，将配体分子流经传感芯片表面，琥珀酰亚胺酯与配体的伯胺基团或其他亲核基团发生反应，将配体共价连接于芯片上。

图1：通过氨基偶联固定配体的化学原理

相信各位老师对氨基偶联的方法也不陌生，那么我们带各位老师来温习一下。

推荐的氨基偶联程序

1

配体富集：确定最佳的预富集条件，以富集足够的蛋白到芯片表面；

2

实验条件：推荐使用流速5-10 ul/min；

3

活化芯片：进样1:1混合的EDC/NHS溶液6-10 min，如果是PEG芯片，进样混合溶液30 s即可； 

4

配体固定：进样配体5-10 min，配体浓度推荐10～100 ug/ml；

5

芯片封闭：进样乙醇胺6~7 min。

这里所推荐的实验条件常用于一般目的的固定需求。配体浓度和进样时间是可以用来控制配体固定量的两个主要因素。如果偶联水平太高，可通过：

  • 减少配体浓度；
  • 减少进样时间；
  • 减少活化时间来控制偶联量。如果需要较少的偶联量 (<500 RU) ，可尝试EDC/NHS以20%/80%混匀，活化30 s即可。

另外，Biacore还可以通过Aim for immobilized level程序实现目标量偶联，无需费心摸索，仪器轻松自动固定配体至合适的偶联量。

氨基偶联如果顺利完成，典型的传感图如下所示：

图2：利用氨基偶联固定配体的典型传感器图

大部分蛋白质含有多个氨基基团，因而可在不严重影响配体生物学活性的前提下进行有效的固定。但是，在某些情况下，氨基偶联中参与反应的氨基可能涉及到配体的活性位点或结合位点附近的基团，因此可能在固定之后导致配体活性的丧失。另外，酸性蛋白由于很难被预富集，无法通过氨基偶联固定在芯片上。在这些情况下，可尝试使用其他偶联化学反应（如巯基、醛基、马来酰亚胺等）固定配体。

巯基偶联

由于蛋白质序列中巯基的数量通常少于氨基（有些蛋白质序列中仅有一个巯基位点），因此，巯基偶联方法有助于以确定的取向固定配体分子。在表面巯基偶联中，由于通过PDEA试剂代替了羧基而在配体分子中引入有反应性的二硫化物，从而提高蛋白质的等电点，改进了静电预富集效果，因此，表面巯基法还可用于酸性蛋白质的固定。

巯基偶联方法利用了巯基和活性二硫化物基团之间的交换反应。当活性二硫化物被引入到芯片葡聚糖基质上，而配体提供结合的巯基，这类方法称为配体巯基法。另一种方式，芯片葡聚糖基质上的巯基与配体的二硫化物结合时，则称为芯片表面巯基法。CM3、CM4、CM5、CM7、C1芯片均可实现巯基偶联。

配体巯基偶联

本身含有巯基的配体蛋白可利用本方法固定在芯片上，利用PDEA将反应性二硫化物基团引入到传感芯片的葡聚糖基质上，实现两者的共价结合。

图3：通过配体巯基偶联固定配体的化学原理

那么配体巯基偶联要怎么实现呢？推荐的实验流程如下：

1

配体富集：确定最佳的预富集条件，以富集足够的蛋白到芯片表面；

2

实验条件：流速5-10 ul/min；

3

芯片活化：进样1:1混合的EDC/NHS溶液2 min； 

4

引入二硫化物基团：进样PDEA 4 min；

5

配体固定：进样配体6～7 min；

6

芯片封闭：半胱氨酸-NaCl 4 min。

配体巯基偶联如果顺利，那么传感图如下图所示：

图4：串联法的典型传感图

芯片表面巯基偶联

芯片表面巯基偶联法是将巯基引入到传感芯片的葡聚糖基质上，并将反应性二硫化物引入到配体分子上。通过巯基-二硫化物交换反应实现配体与芯片表面巯基的偶联。

图5：通过配体巯基偶联固定配体的化学原理

那么实验第一步，就是用PDEA对配体进行修饰，让配体带上反应性二硫化物，此过程还可以提高配体的等电点。推荐实验步骤如下所示，如有需要，可缩小溶液体积。

1

在25°C下，用0.5 mL 0.1 M的MES缓冲液 (pH5.0) 配制1 mg/mL的配体溶液；

2

在MES缓冲液中加入0.25 mL 15 mg/mL PDEA（PDEA的最终浓度为22 mM）；

 

3

加入25 µL 0.4 M EDC（EDC的最终浓度为13 mM）；

 

4

混合，并在25°C孵育10分钟或在冰上孵育1小时；

5

通过适当的缓冲液置换方法去除过多的试剂。

实验第二步，我们需要测定修饰配体的程度。对于PDEA修饰的蛋白质来说，可以通过二硫键的还原和释放的硫代吡啶酮的分光光度法评估结果（最大吸光度波长为343 nm）来大致测定修饰的程度。

1

于280 nm (A280) 和343 nm (A1343) 波长处测定修饰蛋白质的吸光度；

2

在1 ml蛋白溶液中加入50 μl 100 mM的DTE水溶液。混合并于室温反应数分钟；

3

再次测定343 nm波长处的吸光度 (A2343) 。按照下式计算修饰的程度：

图6：计算修饰配体程度的公式

实验第三步，就可以偶联配体了，推荐的实验程序如下：

1

实验条件：流速5-10 ul/min；

2

芯片活化：进样1:1混合的EDC/NHS溶液2 min；

3

引入二硫化物基团：注入胱胺3 min；

4

二硫化物还原：注入DTE 3 min；

5

配体固定：进样配体6~7 min；

6

芯片封闭：注入PDEA-NaCl 4 min，封闭芯片表面。

Tips：进行配体/芯片表面巯基偶联时，运行缓冲液绝不能添加还原剂（如TCEP），因为还原剂会在偶联前还原PDEA，这样偶联化学反应就无法进行。

图7：利用表面芯片巯基偶联固定配体的典型传感器图

马来酰亚胺偶联

在巯基-二硫化物交换反应中，偶联的共价键在还原剂存在或高pH值条件下不稳定，因此，利用该反应进行的配体固定不适用于传感芯片表面暴露于还原剂或高pH值环境的实验。利用配体上的巯基进行共价固定的另一种方法为马来酰亚胺试剂所介导的偶联，这个反应可在配体和葡聚糖基质之间形成硫醚键。CM3、CM4、CM5、CM7、C1芯片均可实现巯基偶联。

用氨基偶联化学反应将乙二胺偶联于传感芯片表面，形成具有氨基基团的表面。硫代-GMBS与氨基反应形成具有马来酰亚胺基团的表面，从而可用来固定含有巯基的配体分子（图4-16）。需要注意的是，氨基表面并不稳定，应在制备之后直接用硫代-GMBS失活。

图8：通过马来酰亚胺偶联固定配体的化学原理

 马来酰亚胺偶联程序

1

配体富集：确定最佳的预富集条件，以富集足够的蛋白到芯片表面；

2

实验条件：流速5-10 ul/min；

3

芯片活化：进样1:1混合的EDC/NHS溶液6~7 min； 

4

引入氨基基团：注入乙二胺溶液6~7 min；

5

引入马来酰亚胺：注入硫代-GMBS 4 min；

6

配体固定：进样配体6~7 min；

7

芯片封闭：半胱氨酸-NaCl 4 min。

如果芯片马来亚酰胺偶联顺利完成，典型的偶联图如下：

图9：利用马来酰亚胺偶联固定配体的典型传感器图

醛基偶联

醛基偶联方法为固定糖蛋白和其他复合糖提供了一种方法。唾液酸残基极易被高碘酸钠氧化生成醛基，因此该方法尤其适用于含唾液酸的配体。含醛基的配体（天然的或由顺二醇氧化而引入）可在传感芯片表面被酰肼或碳酰肼活化之后被固定。CM3、CM4、CM5、CM7、C1芯片均可实现醛基偶联，其化学原理如下图所示。

图10：通过醛基偶联固定配体的化学原理

在固定之前，可使用高碘酸钠氧化法在含顺二醇的配体分子中引入醛基。这一步称之为氧化配体，推荐的程序如下：

1

在100 mM醋酸钠缓冲 (pH5.5) 中制备被氧化配体的1 mg/ml的冷溶液；

2

加入1/50体积的高碘酸钠溶液（高碘酸盐终浓度为1 mM），于冰上孵育20分钟；

3

在脱盐柱上用10 mM醋酸钠缓冲 (pH4.0) 对混合液脱盐以终止反应。

氧化好的配体可按照推荐的程序进行偶联；

1

配体富集：确定最佳的预富集条件，以富集足够的蛋白到芯片表面；

2

实验条件：流速5-10 ul/min；

3

芯片活化：进样1:1混合的EDC/NHS溶液3 min；

4

引入酰肼基团：注入碳酰肼水溶液6~7 min；

5

失活过剩的反应性基团：注入乙醇胺 6~7 min；

6

配体固定：进样配体6~7 min；

7

稳定结合：氰基硼氢酸盐20 min，流速建议使用2 ul/min。

如果醛基偶联顺利，你将会看到以下典型的传感图：

图11：利用马来酰亚胺偶联固定配体的典型传感器图

小 结

看了以上这么多的共价偶联方式，想必各位老师已经跃跃欲试想要尝试一下了。基于非标记技术的Biacore分子互作检测，根据各位老师的样品情况，可以有多种方法固定配体，不仅有氨基偶联，还有巯基偶联、马来酰亚胺偶联，醛基偶联这类进阶玩法，如果您的样品比较与众不同，不妨试一试各类偶联方式，在Biacore上创建您的新偶联方法吧！
Biacore十八般芯片知多少 — L1芯片构建膜蛋白药物筛选体系

Biacore十八般芯片知多少 — L1芯片构建膜蛋白药物筛选体系

Biacore十八般芯片知多少 — L1芯片构建膜蛋白药物筛选体系

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膜蛋白作为细胞膜上的重要分子，身负细胞的“守卫”、“快递员”、“信使”等多重身份，异常的膜蛋白功能与肿瘤、神经退行性疾病、炎症等多种重大疾病相关。据报道，在FDA批准的小分子药物中，以膜蛋白为靶点的药物占60%以上，抗体药物中超过一半也以膜蛋白为靶标。膜蛋白已然成为重要且主要的药物靶点。

天然状态下膜蛋白与细胞膜脂双层相辅相成，而在靶点研究和药物开发中，通常需要将膜蛋白从细胞膜上剥离、纯化出来。膜蛋白的制备包括去垢剂抽提、病毒载体、人造脂质膜、聚合物稳定技术等多种方法，其中利用SMA (styrene maleic acid，苯乙烯马来酸) co-polymer制备蛋白纳米颗粒的技术完全不需要去垢剂，它通过识别膜蛋白质周围的内源性脂质，将目标蛋白质提取到SMA脂质颗粒 (SMALP) 中，从而将蛋白质保留在天然脂质双层的环境中[1]。

小分子抑制剂筛选及检测方法

针对SMALP等lipid vesicles，Biacore独有的L1芯片可以通过疏水修饰的基团实现脂质体捕获，用于膜蛋白靶点与抗体、化合物等各类型药物分子的筛选及亲和力检测。第二军医大学药学院、浙江省食品药品检验研究院的研究团队正是使用SMALP技术与Biacore L1芯片，以膜蛋白P-glycoprotein为靶点，开发了基于Biacore L1芯片的膜蛋白label-free & detergent-free小分子抑制剂筛选及检测方法，并且从多个角度验证了方法的可靠性，相关成果发表在Acta Pharmaceutica Sinica B[2]。
图1：研究路线

L1-SMALPs Chip制备及活性验证

P-glycoprotein (P-gp) 是一种分子量为170 KD的跨膜糖蛋白，它具有能量依赖性“药泵”功能，将细胞内药物泵出细胞，降低胞内药物浓度，使细胞产生耐药性。P-gp的高表达是很多肿瘤细胞多重耐药性的重要因素，因此P-gp是潜在的逆转耐药性靶点。本文选择了高表达P-gp的MCF-7/ADR（人乳腺癌阿霉素耐药细胞株）及对照细胞MCF-7，通过多步离心提取细胞膜，制备SMALP，并且用WB、ELISA验证SMALP中的P-gp。

作者随后选择Biacore L1芯片，分别在实验通道上捕获SMALPs-MCF-7/ADR，参比通道上捕获相当量的SMALPs-MCF-7，使用单一浓度的阳参化合物、阴参化合物及阳参抗体验证了P-gp-SMALPs-L1 chip的特异性和活性。明确了芯片的特异性及活性之后，作者检测了SMALPs-MCF-7/ADR与阳参药物valspodar的准确亲和力（图2），进一步使用参比分子验证了方法的可靠性。

图2：使用Biacore L1芯片检测SMALPs-MCF-7/ADR与valspodar的亲和力

Biacore L1芯片助力P-gp抑制剂筛选更高效

为了开发新的P-gp抑制剂，作者选择了50种天然产物，使用P-gp-SMALPs-L1 chip进行了结合水平的筛选，最终得到了Tetrandrine等9种化合物（图3）。针对P-gp-SMALPs-L1 chip的筛选方法，作者指出：

 1 

传统的P-gp抑制剂筛选方法基于细胞，耗时数天，而Biacore L1芯片的方法仅需数小时，更加快速且特异性良好；

 2 

SMALP中的P-gp是非定向的，P-gp-SMALPs SPR筛选方法可以同时筛选靶向P-gp胞内域及胞外域的化合物。

图3：使用P-gp-SMALPs-L1 chip进行药物筛选

亲和力检测+细胞实验证明筛选方法可靠性

筛选得到9种化合物后，作者使用Biacore同样检测SMALPs-MCF-7/ADR与各个化合物的准确亲和力，结果说明9种化合物都有比较好的结合能力（表1），并且证明了筛选方法的可靠性。除了考虑KD外，文中也考虑了Rmax等更多结合信息。
表1：使用P-gp-SMALPs-L1 chip进行药物亲和力检测
P-gp抑制剂有潜在的逆转耐药性作用，最后作者使用细胞实验分别验证了几种化合物是否可以逆转耐药性及抑制P-gp“药泵”功能。结果发现包括tetrandrine在内的几种化合物都明显抑制P-gp活性，并且与已报道的tetrandrine促进细胞中药物积累的结果相符合（图4）。细胞实验的结果进一步证明P-gp-SMALPs-SPR筛选及检测方法的可靠性。
图4 ：P-gp抑制剂的逆转耐药性检测及活性抑制检测

综上，作者使用Biacore建立了一种膜蛋白label-free & detergent-free药物筛选检测方法：通过制备具有更天然构象的膜蛋白-SMALP，利用Biacore L1芯片，捕获膜蛋白-SMALP，从筛选到精准亲和力表征，用Biacore发现了新的具有潜在逆转抗药性的小分子抑制剂。这也是首次将SMA膜蛋白稳定技术与SPR结合起来，进行复杂膜蛋白靶点的药物筛选及亲和力检测，并且得到了有效的潜在抑制剂。

工欲善其事，必先利其器。膜蛋白的研究十分繁杂，而如何化繁为简，开发出既保证准确性，又能加快靶点研究及药物开发的研究方法，同样是科研工作者的重要研究领域。Biacore作为最经典的体外互作技术，开发了针对各类型生物分子的传感芯片，不需样品预处理，即可满足各种生物分子的互作检测需求，是科研工作者手中基础科研及药物开发的真正利器。

Biacore，for a better life