CHO细胞培养抗体质量调节：抗体半乳糖基化和岩藻糖基化调控

2 月 10, 2026

单克隆抗体（mAbs）在治疗多种疾病方面非常有效，并已成为生物治疗行业增长的推动力。

单克隆抗体通常由悬浮适应的中国仓鼠卵巢(CHO)或鼠骨髓瘤细胞通过补料分批的方式生产。产品放行的关键产品质量规范包括蛋白质糖基化、电荷变异和其他蛋白质修饰。免疫球蛋白G1（IgG1）同种型内的所有单克隆抗体在其蛋白质结构中共享保守区域，并在Fc区CH2结构域内的Asn297残基处进行N-糖基化。N-糖基化是一种异质的、非模板导向的翻译后修饰，始于分泌途径第一隔室（内质网）Asn297残基上低聚糖的添加和初始重塑。

进一步的反应发生在第二个隔室——高尔基体中，对初始低聚糖的酶修饰导致两个N-乙酰葡糖胺糖和一个双天线三甘露糖核心的基础结构。当抗体在分泌前穿过高尔基体时，三甘露糖核心的每个天线都可以用额外的N-乙酰葡糖胺、半乳糖和唾液酸残基进一步修饰。虽然其他蛋白质的糖基化模式可能更加多样化，但由于Fc区和糖基转移酶之间的空间相互作用，单克隆抗体的结构多样性有限。不同的末端糖会影响抗体稳定性、血清半衰期和治疗功能，核心N-乙酰葡糖胺残基的岩藻糖基化会显著影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。

事实上，核心岩藻糖基化减少可以使ADCC增加100倍，末端半乳糖基化增加可以增加补体依赖性细胞毒性。最终分泌的抗体池因特定糖型的丰度而异，其中某些聚糖末端基团比其他基团更普遍。因此改善半乳糖基化以及岩藻糖基化对于改善重组蛋白CQA是非常必要的。

材料与方法

细胞：CHO-K1
测试添加剂：2-F-过乙酰基岩藻糖（2-FP）、半乳糖（Galactose）、尿苷（Uridine）
培养模式：使用50 mL的TPP管进行培养，培养条件：接种密度5×105 cells/mL，温度37 ℃，5%CO2，工作体积30 mL，培养天数7天。每天取样，测细胞密度、活率和生化指标。

结果

1、细胞生长特征和代谢物分析

细胞在实验设计的每种条件下都遵循典型的生长行为，在第7天的批次结束时， VCD峰值在290万至430万个细胞/ml之间（图1）。与未补充的分组相比，在50 μM 2FP或100 mM半乳糖存在下生长的细胞没有表现出显著不同的生长行为（图1a，b），但补充200 μM尿苷导致VCD从第4天开始显著升高，并持续到第7天培养终止（图1a；D4，p=.017；D7，p=.003）。此外，与未补充的分组相比，补充了尿苷的细胞的VCD峰值高出23%。

图1 补充培养基对活细胞密度（VCD）的主要影响

在每种实验条件下，在整个批次中监测葡萄糖和乳酸浓度（图2a-c）。与未补充的对照组相比，补充2FP对葡萄糖或乳酸谱没有显著影响。然而，从第0天到第2天，与非补充对照组相比，补充尿苷的分组葡萄糖消耗率略有降低，补充半乳糖的摇瓶显示出从第4天到第7天葡萄糖消耗率的变化。在第2天和第4天，补充尿苷的分组中的乳酸浓度显著低于未补充对照组（D2，p=.0007；D4，p=-0003），并且在第7天终止培养时仍低于未补充的对照组（p=0.16）。

图2 补充剂对代谢的主要影响

2、滴度与细胞产量分析

在第4天或第7天，在每种补充剂组合存在下生长的细胞滴度与未补充的对照组没有显著差异（图3a；D4，p=.18；D7，p=0.18）。然而，添加尿苷的分组在第7天的比生产率（pg/细胞/天）明显低于未补充的对照组，约为50%（图3b；p<0.05）。补充物对滴度的主要影响如下：在50μM 2FP或100 mM半乳糖存在的情况下，与未补充对照组相比，第4天和第7天的滴度没有显著差异（2FP:D4，p=.65；D7，p=.24；半乳糖：D4，p=0.44；D7）。然而，在200μM尿苷存在的情况下，第4天的滴度下降了34%，第7天下降了30%（尿苷：D4，p=.01；D7，p=.005；图3c，d）。

图3 添加补充剂对滴度以及产量的影响

3、糖型分析：半乳糖基化和岩藻糖基化

通过裂解的聚糖分析和UPLC测定，未经补充产生的抗体具有典型的第7天糖谱的Fc-糖基化（图4），糖型包括丰度约为74％的G0F峰，总岩藻糖基化率为90％，总半乳糖基化率为16％，并且没有可检测到的甘露糖-5末端糖或唾液酸。

图4 添加补充剂对糖基化影响

与第7天的对照摇瓶相比，添加半乳糖的培养物产生的抗体的G0聚糖相对丰度降低21％，同时G1或G2聚糖相对增加。此外，在第4天和第7天之间，G0聚糖相对丰度增加未接受半乳糖补充剂的摇瓶中平均减少5-10％。在添加半乳糖的摇瓶中，G0聚糖的相对丰度在第4天和第7天之间基本保持恒定。尿苷和2FP的添加均显着影响相对抗体的半乳糖基化，但其作用远小于半乳糖。补充2FP导致相对半乳糖基化减少4％，尿苷增加2％。2FP和半乳糖之间的相互作用也显着影响D7半乳糖基化（p<.05），但该作用远小于单独半乳糖的主要作用。

本研究中的三种补充剂均显著影响了抗体岩藻糖基化（p<0.05）。添加50 μM 2FP对岩藻糖基化影响最大，和对照相比组相比，添加50 μM 2FP分组第4天和第7天岩藻糖基化减少了48%。虽然没有在补充2FP的样本中观察到的那么大的变化，但在200 μM尿苷存在的情况下，第4天和第7天的相对抗体岩藻糖基化降低了约7%，补充100 mM半乳糖的培养物使岩藻糖基化增加了约5%。2FP、尿苷和半乳糖之间每种可能的双向和三向相互作用都会显著影响D7岩藻糖基化（p<0.05），但与单独使用2FP的主要作用相比，相互作用的影响很小。

4、基因表达分析

每种补充剂都改变了关键糖基转移酶和其他糖基化相关基因的信使RNA（mRNA）表达水平。在第4天和第7天获取细胞样本，提取mRNA并进行分析。在第4天，与未补充的对照组相比，补充200 μM的尿苷显著增加了MGAT1、B4GALT1、B4GALT2、B4GALT3、B4GALT4、B4GALT5、B4GALT6和SLC35A3（尿苷二磷酸[UDP]-N-乙酰基-D-葡糖胺[GlcNAc]转运蛋白）的表达（p<0.05）（图5）。

图5 补充剂对基因表达的影响

在第4天，在100 mM半乳糖存在下生长的细胞显示出MGAT2、MGAT5和B4GALT3-4表达的显著变化（p<0.05）。在第4天，50 μM的2FP补充导致MGAT5、B4GALT1、B4GALT4、B4GALT5、B4GALT6和FUT8表达以及包括SLC35A3、SLC35A2（UDP-Gal转运蛋白）和SLC35C1（鸟苷二磷酸[GDP]-Fuc转运蛋白）在内的多核苷酸糖供体转运蛋白基因显著下调（p<0.05）。

表1总结了2FP、尿苷和半乳糖对第4天基因表达的影响。在第7天，与未补充的对照组相比，补充剂对基因表达的影响较小。这可能是因为补充剂和其他培养营养素的消耗，因为随着批次接近终止，细胞代谢和生产力减慢。

表1 补充剂对糖基转移酶关键基因表达的影响

2FP的添加能明显降低抗体岩藻糖基化，半乳糖的添加明显增加半乳糖基化，尿苷的添加能降低岩藻糖基化和增加半乳糖基化。尿苷能提高细胞密度，但会降低滴度。补充剂添加后在培养的第4天引起基因表达发生显着变化，其中添加2FP显着降低岩藻糖基转移酶8和核苷酸糖转运蛋白基因表达，尿苷添加显着提高UDP‐GlcNAcT（SLC35A3）和B4GALT1–6的表达。这些基因表达结果与糖基化、代谢和生长结果一起提高了我们对培养基补充剂影响的细胞机制的理解。

HyClone对培养基的原材料把控都有非常严格的指标，能稳定的提供各种CHO细胞培养基，包括：Actipro、HyCell、PSL A01和PSL A02等基础培养基以及Cell Boost 7a、Cell Boost 7b等多种补料。

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