为了向您推荐更精准的技术资料，请补充您的研发需求..... 前往补充

小试很好，放大就变？CHO工艺放大中的三大隐藏变量

8 月 11, 2026

近年来，随着CHO工艺向高密度、高产量和更大规模发展，工艺放大已成为抗体开发中最具挑战性的环节之一。许多项目在2 L、10 L甚至50 L阶段表现良好，但进入200 L、2000 L或更大规模后，仍可能出现细胞生长下降、乳酸代谢异常、产量降低或糖型漂移。更值得关注的是，这些问题有时发生在pH、DO、温度和补料策略等传统CPP均保持一致的情况下。

越来越多案例提示，放大失败并不一定来自“工艺参数没有照搬”，而可能来自小规模模型没有覆盖生产规模中真实存在的微环境差异。本文聚焦三个容易被忽视的变量：pCO₂ 积累、气体入口速度升高和金属离子析出。其中，气体入口速度（GEV，Gas Entrance Velocity）指气体从鼓泡器孔口进入培养液时的局部速度。它们分别来自传质、流体力学和设备材料三个领域，却都能在CPP正常的情况下改变细胞表现或关键质量属性CQA。

为什么传统放大思路会失效？

工艺开发人员通常习惯于把放大理解为一个工程相似性问题，例如保持相同P/V、相同kLa、相同DO、相同培养基和补料策略。如果这些条件都满足，理论上细胞应该看到相同的培养环境，从而获得相似的培养结果。

但反应器放大改变的不只是体积。随着规模增加，至少有三类微环境会被重新塑造。

第一：气体在液体中的停留和逸出方式改变，可能导致CO₂去除能力不足，形成高pCO₂与渗透压、pH变化的组合压力。

第二：为了满足供氧或脱除CO₂而增加通气时，如果鼓泡器孔径和孔数没有同步优化，气体会以更高速度从孔口喷出，形成气体入口速度升高和局部剪切风险。

第三：小规模与大规模的材料暴露方式不同，探头、搅拌轴、挡板等部件可能带来不同的金属离子背景，进一步影响糖型等质量属性。

这些变化往往不会直接反映在传统CPP中，却能够真实影响细胞所处的微环境，最终导致“Scale-up failure”。

今天，我们用三个案例来讨论：为什么明明工艺没变，放大后却失败了？

Case 1 氧气够了，为什么细胞反而长不好？

pCO₂积累

很多工艺放大时，工程师最关注的问题往往是氧气传递。小罐放大到大罐后，为了维持相同DO，人们会关注kLa、通气量和搅拌功率是否足够。然而在BMS的抗体融合蛋白B1案例中，放大后真正的问题并不是氧气供给不足，而是CO₂排不出去。

随着反应器规模增大，单位体积气体流量VVM通常会下降。虽然氧气传递可以通过富氧或纯氧得到保证，但CO₂去除效率却可能明显下降。其结果是培养液中pCO₂持续积累，并伴随osmolality升高。

图1. Bench scale与production scale中细胞活率和蛋白B1产量表现对比

图1显示，台式规模中细胞活率在培养后期仍维持较高水平，蛋白B1的相对产量持续上升；而生产规模中，细胞活率从培养后期开始快速下降，蛋白B1累积明显放缓。该项目从小规模放大到生产规模后观察到约50%产量下降，同时伴随较高pCO₂和渗透压。

研究者随后把生产规模中同时升高的两个变量pCO₂与渗透压拆开分析，判断单一因素是否足以解释放大失败。

图2. 单独升高渗透压并不能完全复现生产规模中的放大失败

图2显示，单独将渗透压升高到400–450 mOsm/kg时，细胞密度和活率与对照组差异并不明显；只有进一步升高到460–500 mOsm/kg，培养后期细胞状态才出现更明显下降。

结合文献中高pCO₂与高渗透压组合条件下细胞密度下降更明显的结果，可以看出该案例的关键并不是“渗透压一定导致失败”，也不是“pCO₂单独决定失败”，而是放大后CO₂、碳酸氢盐、pH控制和渗透压共同改变了细胞代谢环境。

大罐的问题很多时候不是氧气不够，而是CO₂排不出去。

从工程实现角度，pCO₂控制不仅取决于培养基和pH策略，也与反应器通气设计有关。以Cytiva XDR一次性反应袋为例，不同通气孔径可用于平衡氧传递和CO₂去除。实际高密度培养中，常见思路是使用较小孔径满足氧气传递，同时使用较大孔径或空气通气增强CO₂去除；对于1000 L、2000 L等大规模培养，也可通过T-Sparger等设计提高CO₂ stripping能力，降低高pCO₂风险。

对客户来说，更关键的问题是：发现pCO₂风险后，工程上如何降低CO₂积累？这就需要回到反应器通气设计本身。

图3. Cytiva XDR 2000 L pCO2分压控制和通气量大致关系

图4. Cytiva XDR 2000 L CO₂ Stripping kLa

这部分工程数据可以作为pCO₂ Case的应用补充，说明pCO₂控制并不只是培养基或pH策略问题，也与反应器通气设计密切相关。

Case 2 解决了CO₂，却又损伤了细胞

GEV升高

如果说第一个案例告诉我们需要增加气体流量来去除CO₂，那么第二个案例则告诉我们：增加气量本身也可能成为新的问题。

气体入口速度GEV是气体从Sparger孔口进入培养液时的局部速度。它不是由规模本身决定，而是由气体流量、孔径和孔数共同决定。同样是通气，细胞感受到的并不是平均VVM，而是气体从孔口喷出时的局部入口速度。孔径越小、孔数越少，在相同气体流量下GEV越高。

GEV这个风险在Chaudhary等发表的CHO放大研究中被系统展示。该文章的核心结论是：

高气体入口速度是CHO工艺放大中容易被忽略的细胞损伤来源；当大规模鼓泡器孔径和孔数不足以匹配通气需求时，局部高速气流会造成细胞培养表现下降，而通过增大孔径、增加孔数降低气体入口速度，可以改善大规模培养结果。

表1. 不同规模和Sparger设计下的Peak GEV对比

表1显示，在相近单位体积通气水平下，2 L反应器中7个1 mm孔的鼓泡器对应Peak GEV约0.4 m/s；而单个0.1 mm孔可将Peak GEV推高到约265 m/s。类似地，在12,000 L规模中，25个0.76 mm孔的设计对应Peak GEV约170 m/s，而增加孔数并放大孔径后，Peak GEV可降至约20 m/s。

这说明，放大过程中不能只看总通气量，还需要关注鼓泡器局部孔口速度。当GEV被推高后，细胞并不是均匀受到平均剪切，而是在鼓泡器附近反复经历局部高速气流冲击。

图5. 2 L、100 L与12,000 L规模中细胞培养表现及GEV对比

图5比较了不同规模下的活细胞密度、细胞活率、相对产量和气体入口速度。可以看到，12,000 L条件下气体入口速度明显高于2 L和100 L对照，并且培养后期活细胞密度和活率下降更快，相对产量也低于小规模对照。该结果说明：即使整体通气策略看似可以满足溶氧需求，鼓泡器孔口的局部高速气体冲击仍可能导致细胞培养表现下降。

这个案例说明：

为了去除CO₂，我们往往会增加气量；而增加气量，又可能带来GEV升高；GEV升高后，又会损伤细胞。

更进一步，来自WuXi Biologics的研究把GEV和pCO₂放到了同一个高密度CHO放大场景中。在2000 L一次性反应器放大过程中，研究者发现产量下降与气体入口速度升高和pCO₂积累同时相关。为了验证这一假设，研究者通过改造3 L小规模反应器鼓泡器来模拟高气体入口速度和高pCO₂条件，并最终通过升级2000 L反应器鼓泡器设计和优化通气策略，实现pCO₂与气体入口速度的同步控制。

图6. 通过改良Sparger设计同时控制pCO₂与GEV，可恢复2000 L放大表现

图6中，原始2000 L XDR受限于鼓泡器总开孔面积，难以在有效CO₂去除与控制气体入口速度之间取得平衡；改良设计扩大了鼓泡器开孔面积，并结合通气策略优化，使生产过程中pCO₂控制在<50 mmHg，同时GEV控制在<30 m/s，最终使改良2000 L反应器的产量恢复到接近3 L小规模水平。

解决一个问题的同时，可能正在创造另一个问题。CO₂控制和气体入口速度控制必须放在同一个工程窗口中评估。

Case 3 工艺没变，糖型为什么变了？

金属离子析出

前两个案例中，放大失败主要表现为细胞状态或产量下降。但有些放大问题更隐蔽：细胞密度、活率和titer看起来都没有明显异常，产品质量属性却已经发生偏移。Pfizer的Manganese leaching案例就是一个典型例子。

在这个案例中，同一个CHO细胞株、同一个培养基、同一个工艺条件，只因为培养设备不同，最终终末端糖基化出现了显著差异。

图7. 2 L、100 L和6000 L不同规模下mAb终末半乳糖基化差异

图7显示，2 L玻璃反应器中的终末半乳糖基化水平明显高于100 L，且数据波动更大；6000 L单点结果更接近100 L。也就是说，2 L小规模模型在该项目中不能代表中试或商业化规模的糖型表现。

这个案例最有意思的地方在于，问题并不是细胞长不好，也不是产量明显异常，而是糖型在不同规模之间对不上。

它说明：

放大失败不一定表现为细胞死亡，也可能表现为质量属性偏移。

发现2 L与100 L、6000 L糖型不一致后，研究者进一步追问：2 L系统中到底多了什么？后续金属元素检测和添加实验，把答案指向了一个非常微量、但足以影响糖型的变量：Mn离子。

图8. Mn离子随培养时间析出，并呈剂量依赖性提高mAb终末半乳糖基化水平

图8a显示，在完全组装的2 L玻璃反应器中，Mn离子浓度随暴露时间逐渐升高，提示不锈钢部件可向培养体系中持续释放微量Mn。图8b显示，外源添加不同浓度Mn后，mAb终末半乳糖基化水平随Mn浓度升高而增加，说明纳摩尔级Mn差异已足以改变糖型表现。

这两部分结果合在一起，完成了从“现象”到“机制”的闭环：2 L玻璃反应器并不是因为玻璃本身导致糖型偏高，而是因为其中的搅拌轴、探头、挡板或其他不锈钢部件带来了更高的单位体积金属暴露风险。而Mn又是半乳糖基转移酶相关的金属辅因子之一，因此即使是很低水平的Mn背景差异，也可能被放大成终末半乳糖基化差异。

对于这一类问题，Pfizer案例用于说明：

金属离子析出会导致小规模模型对CQA的预测失真。

正大天晴案例则进一步补充说明：

类似问题在实际scale-up中也会发生，并且可以通过调节Mn背景水平或更换模型体系进行纠偏。

图9. 添加MnCl₂·4H₂O可消除由Mn leaching引起的糖型scale difference

正大天晴案例研究显示，随着MnCl₂·4H₂O添加浓度升高，摇瓶和2 L之间的半乳糖基化差异逐渐缩小；在0.2 μM条件下，摇瓶与2 L的半乳糖基化几乎一致，分别为23.7%和24.2%。这一结果也在50 L规模进一步验证。相反，添加40 mM半乳糖并不能消除不同规模之间的差异。

这个结果说明：

如果规模差异的根因来自2L玻璃反应器释放的微量Mn，那么可以通过统一不同规模中的Mn背景水平，来减少糖型差异。放大失败并不总是通过提高转速、调整通气或修改补料来解决。有时真正需要控制的是一个非常微量、但对CQA高敏感的背景变量。对于糖型敏感项目，小规模模型是否可靠，不仅要看细胞生长和产量是否一致，还要确认材料暴露和微量元素背景是否可比。

生物反应器并不总是一个中性的培养容器。它本身也可能成为培养基成分的一部分。