CHO细胞糖基化如何调控？六大工艺参数分析与解读

糖基化（glycosylation）作为一种翻译后修饰，是影响治疗性抗体生物学功能、稳定性、蛋白折叠、免疫原性以及效应功能的关键质量属性（critical quality attribute, CQA）。尽管已有大量研究考察了工艺参数（process parameters, PP）对糖基化的影响，但由于缺乏标准化的报告方式，不同研究之间难以进行比较，也难以得出明确结论。

通过采用标准化的糖链指数法（Glycan Index, GIx），可对大量文献数据进行重新整合和定量分析，从而客观评估工艺参数对CHO细胞中糖型分布的影响。以下主要分析温度、pH、溶氧、二氧化碳分压、渗透压和化学添加剂等因素对抗体糖基化的影响。

在生产阶段调节培养温度是一种被广泛采用的工艺策略，并已在生物制药行业中形成常规应用。

常见的温度调控方式包括：

（1）从培养开始即在低温条件下培养细胞（图1A）；

（2）在培养后期将温度由37 °C下调至30–35 °C（图1B）；

（3）采用周期性温度转换培养策略（图1C）。

研究表明，降低培养温度可能影响半乳糖化和岩藻糖基化水平，从而进一步影响抗体的生物活性。在统计的九项研究中，一项研究显示Glycan Index（GIx）增加≥10%，三项研究显示GIx降低≥10%，其中仅一项研究报告了较大幅度的下降。其余多数案例中，半乳糖化水平变化较小，而唾液酸化水平通常保持不变。

温度对GIx产生影响的一个合理解释是，温度降低会触发多种细胞响应，包括降低细胞代谢水平和细胞增殖速率，以及改变核苷酸糖供体转运蛋白和糖基转移酶的表达。同时，低温还会减缓除重组单克隆抗体之外的内源性蛋白分泌，从而可能减少其对细胞资源的竞争。

在降温条件下，通常可观察到比生产速率（specific productivity, qP）升高，这可能缩短抗体在分泌通路中的停留时间，尤其是在糖链前体供应有限的条件下，进而影响最终糖型分布。

pH是细胞培养过程中的关键工艺参数，通常通过CO₂通气或添加碱液进行控制，并维持在7.0左右。

常用碱液包括氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠等。分析发现，当pH偏离基线水平时，并未观察到一致性的糖基化响应趋势（图2）。

在某些情况下，pH>7.0会导致糖链异质性增加；而在另一些情况下，糖链异质性反而降低。当pH降至7.0以下时，半乳糖化指数（Galactosylation Index,GI）增加了2.32%，唾液酸化指数（Sialylation Index,SI）降低了0.7%；而pH>7.0对这些指标的影响可以忽略不计。

然而，即使针对相同产品和相同细胞系，也观察到了相互矛盾的结果，这使得建立一个普适性框架来描述pH对糖基化的影响较为困难。在GIx发生变化的案例中，这种变化主要体现在半乳糖化水平上，且ΔGIx通常低于10%。

从机制角度来看，在较低pH条件下，例如pH6.7，细胞外过量质子可能会升高细胞质pH，并进一步提高内质网和高尔基体腔内的pH，从而破坏高尔基体内的pH梯度。此外，内质网到高尔基体的囊泡运输增强，也可能缩短蛋白质在分泌通路中的停留时间，导致携带部分加工糖链的蛋白质提前释放。

溶氧（dissolved oxygen,DO）是另一个关键工艺参数，通常以溶解氧张力（dissolved oxygen tension,DOT）的形式进行监测，设定值一般约为20%–50%。

氧传递受多种因素影响，包括气体流速、进气中的氧分压、气泡大小、搅拌速率以及搅拌桨设计等。低DO水平可诱导缺氧，而高DO水平则可能引起氧化应激和活性氧的产生。这两种情况均可能损害细胞生长、细胞存活、单克隆抗体产量以及产品质量。

目前，仅有少数研究系统性地考察了DO变化对糖基化的影响。大多数研究报道GIx的变化较小，即ΔGIx<1.0%（图 3A–C）。为了缓解高DO条件下的氧化应激，可在培养基中补充抗氧化剂，以减少ROS生成并防止氧化损伤。有研究在培养基中补充了黄芩素以及S-磺基半胱氨酸；但结果显示，当DO控制在50%空气饱和度时，糖基化指数未发生显著变化（图3D）。

在这些案例中，半乳糖化水平仅有轻微升高，ΔGIx变化幅度约为2%–5%。然而，这些研究并未开展挑战性实验，即未验证抗氧化剂补充是否能够在高DO条件下发挥缓解作用。

pCO₂也会影响细胞培养表现，其作用主要与pH控制相关。通常，哺乳动物细胞培养条件设定为5% CO₂，并根据需要进行调整以维持pH稳定。目前，对CO₂如何影响单克隆抗体糖基化的理解仍然有限，部分原因在于CO₂的变化会间接影响其他工艺参数，例如pH。研究显示，将pCO₂提高至5%以上会使半乳糖化指数（Galactosylation Index,GI）略有降低，变化幅度为ΔGIx<5%，但不会影响岩藻糖基化或唾液酸化水平（图3E）。

渗透压是影响细胞生长、细胞活率和生产力的关键工艺参数之一。

在培养过程中，由于补料添加或代谢副产物积累，渗透压通常会逐渐升高。哺乳动物细胞培养中的典型渗透压范围为280–320 mOsm/kg。然而，通过添加NaCl诱导高渗透压，可提高细胞比生产速率。

在所分析的多项研究中，渗透压升高导致半乳糖化指数（Galactosylation Index,GI）下降，ΔGIx变化幅度约为10%（图4）；同时，岩藻糖基化指数（Fucosylation Index,FI）也下降，ΔGIx约为2%–10%。这种对半乳糖化和岩藻糖基化水平的显著影响，可能会进一步影响单克隆抗体的治疗功能。

从机制上看，升高的渗透压会下调参与糖基化过程的相关基因，包括编码核苷酸糖转运蛋白和关键糖基转移酶的基因，从而限制底物和辅因子的可用性，并导致糖链加工程度降低。该现象也提示，在强化分批补料工艺中，渗透压的剧烈波动可能进一步改变糖基化模式。因此，当通过提高渗透压来增强生产力时，需要采取相应的工艺控制措施，以维持产品质量的一致性。

在哺乳动物细胞培养中，可通过添加多种化合物来提高产量和细胞比生产速率。

这些分子包括单独或联合诱导细胞周期阻滞的化学物质，例如细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）抑制剂；化学伴侣分子；内质网（ER）应激抑制剂；以及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）抑制剂，如丁酸钠、戊酸等。

在所分析的案例中，化学添加物对半乳糖基化的影响存在一定差异。其中，约一半案例显示ΔGIx变化幅度约为6%，而其余案例中的影响较小，ΔGIx<1.5%；同时，这些添加物通常不影响岩藻糖基化水平（图5）。丁酸钠可改变糖基化通路中多个基因的表达，包括锰转运蛋白基因（slc39a8）。然而，这种影响幅度不足以显著改变抗体的糖基化特征。

CDK4/6抑制剂可诱导CHO细胞发生G0/G1期阻滞，并提高半乳糖和岩藻糖占有率，ΔGIx变化幅度约为2%–5%（图5B）。将二甲基亚砜（DMSO）与BiP诱导剂X（BIX）联合使用，可在发挥化学伴侣作用的同时，缓解DMSO诱导的ER应激，从而增强B4galt表达并改善糖链占有率。

补充forskolin可通过诱导G0/G1期阻滞和抑制Bcl-2基因表达来提高qP。尽管forskolin可增强末端半乳糖基化，但采用GIx方法评估时，该影响较小（图5B）。化学添加物的应用高度依赖于具体工艺过程，其与糖链变化结果之间的分子机制联系仍需进一步研究。

尽管工艺参数会影响糖基化，但多数情况下其影响幅度较小、稳定性不足且可重复性有限，因此较难作为主要的糖工程（glycoengineering）手段。

总体而言，GIx等定量化、标准化分析方法为客观比较不同工艺参数对单克隆抗体糖基化的影响提供了重要工具。

在大多数情况下，环境因素扰动对岩藻糖基化指数（Fucosylation Index,FI）、半乳糖基化指数（Galactosylation Index,GI）和唾液酸化指数（Sialylation Index,SI）的影响均低于10%，其中许多变化甚至低于5%。然而，在某些特定情况下，尤其是涉及温度和渗透压变化时，工艺扰动可能改变岩藻糖基化和半乳糖基化水平，从而产生重要的生物学影响。

此外，这些与工艺相关的效应在不同细胞系、不同产品以及不同培养模式之间存在显著差异；即使在相同工艺条件下，不同生产批次之间也可能出现不同的糖基化结果。因此，现有研究数据表明，仅依靠调整工艺参数并不是实现目标糖基化谱的可靠策略。

一种更合理的策略是在既定操作范围（Operating Region）或设计空间（Design Space）内对工艺参数进行稳定控制，并结合针对性的培养基优化措施，例如在培养过程中补加galactose、Mn²⁺、uridine、微量元素和激素等。此外，也可通过细胞遗传工程改造实现更有效且更可预测的糖基化调控，例如FUT8敲除、糖基转移酶改造以及核苷酸糖转运体改造等。

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