智荟智选 | 双抗纯化下游填料选型与工艺方案

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）疗法凭借其高度特异性和精准干预能力，显著推动了肿瘤治疗的发展。然而，在临床应用过程中，耐药机制的产生以及肿瘤异质性的存在仍然是亟待解决的问题。

由于单一靶点难以覆盖全部肿瘤细胞，mAb的治疗效果往往受到限制，从而催生了对新型肿瘤治疗策略的迫切需求。

双特异性抗体（bispecific antibodies，bsAbs）作为一种新兴的治疗药物，通过同时靶向两种不同的抗原或信号通路，能够协同干扰多条信号级联反应，抑制肿瘤免疫逃逸机制，并诱导更加持久的治疗反应，从而在一定程度上克服了单克隆抗体在肿瘤异质性和获得性耐药方面的局限性^[1]。

从结构上看常见的双特异性抗体（bsAbs）可以分为包含Fc区域的双抗（对称结构双抗与不对称结构双抗）与不包含Fc区域的双抗（图2）。

鉴于双特异性抗体在结构复杂性上较单克隆抗体显著提高，且产物异质性更加突出，其纯化工艺难度普遍高于单克隆抗体。本文围绕双特异性抗体纯化过程中面临的关键工艺挑战，系统介绍了Cytiva相关产品在双特异性抗体纯化中的具体应用及其解决方案。

双特异性抗体为实现功能，往往会牺牲了Fc区域的“规则性”，因此常规亲和或色谱手段（最典型是Protein A）难以高效、稳定、选择性地捕获目标双特异性抗体分子。Cytiva针对抗体不同的结合位点提供了多种捕获填料（图3），可以依据双抗分子结构特点选择合适的捕获填料。

对于同时有多个结合位点的抗体分子，比如Fab，建议首先进行填料筛选，选择出最合适的填料；多个Fab片段的筛选结果显示使用VL、VH3载量显著高于使用Protein A填料的结合载量（图4）。

双特异性抗体的纯化过程中，部分双抗分子在低 pH 条件下表现出结构不稳定的问题。其原因可能在于双抗分子不对称的抗体结构降低了局部构象稳定性，并导致电荷分布更加复杂，从而在低pH条件下更容易发生解折叠、错配或聚集。因此，此类双特异性抗体并不适合采用传统依赖低pH的洗脱方式。

针对这一挑战，Cytiva推出了可在中性至温和条件下实现洗脱的抗体亲和填料MabSelect Mild Elution。该填料可在约pH5的条件下实现有效洗脱，从而显著降低低pH对抗体结构稳定性的不利影响。

双抗分子纯化过程中为了减轻精纯步骤的压力，往往需要捕获步骤在抗体捕获的同时具有一定的杂质（聚集体、同源二聚体、半抗等）去除能力。

Protein A亲和填料不能有效去除杂质，此时可以考虑使用MabSelect VL、MabSelect VH3等亲和捕获填料。比如MabSelect VH3结合VH3重链可变区，能够根据抗体分子中VH3结构域数量的差异，实现产物与杂质的分离。文献报道中通过梯度洗脱的方式有效的分离聚体和半抗，进而得到纯度较高的目标抗体分子（图6）^[3]。

由于双特异性抗体分子具有显著的结构异质性特征，在亲和捕获后，样品中仍可能残留较多杂质，如聚集体、同源二聚体及半抗体等，这对后续精纯步骤的杂质去除能力提出了更高要求。当传统色谱填料在杂质去除方面效果有限时，可考虑引入复合模式填料进行优化。

如图8所示，在相同工艺条件下，复合模式填料相较于传统阳离子交换填料表现出更优的聚集体去除能力；同时，Capto MMC ImpRes在去除 Protein A残留方面的性能亦优于传统阳离子填料Capto SP ImpRes。

在抗体片段的纯化工艺中，将Capto MMC ImpRes和Capto adhere ImpRes两种复合模式填料作为精纯步骤的核心分离介质，最终获得了高纯度、高质量的抗体片段，同时整体收率仍维持在较高水平（图9）。

与单克隆抗体相比，双特异性抗体在结构复杂性和产物异质性方面均显著增加，因此其纯化难度远高于单克隆抗体。针对这一挑战，Cytiva从捕获和精纯两个关键步骤入手，系统性地提供了相应的解决方案。

• 在捕获阶段，通过提供多种类型的亲和填料，提高亲和捕获效率的同时有效降低相关杂质水平；
• 在精纯阶段，可采用复合模式填料，该类填料具有独特的选择性，在常规方法难以去除杂质的项目中往往表现出良好的分离效果。

实际应用中，需要结合具体双特异性抗体的结构特征及杂质组成，合理选择合适的填料与工艺路径，以实现双特异性抗体的高效纯化（图10）。