变黄、变粉？蛋白原液颜色形成机理与上游控制策略

但相比法规要求，更值得关注的是，蛋白颜色往往关联着蛋白自身质量变化。不同颜色背后可能对应不同的潜在风险，例如黄色可能与Trp氧化相关，棕色可能与糖化及AGE形成相关，粉红色可能与VB12结合及二硫键还原相关，而棕红色则可能提示金属离子络合。颜色加深也常常意味着ROS升高和氧化应激增强。

在细胞培养、纯化、储存或光照过程中，ROS、金属离子和光照都可能促进Trp氧化。Trp经多步氧化后可形成犬尿氨酸（Kyn）、N-甲酰犬尿氨酸（NFK）等有色降解产物，这些产物会使蛋白溶液呈现黄色或黄褐色。

铁离子在这里扮演了一个“双刃剑”角色：一方面，铁是CHO细胞生长和代谢所需的重要微量元素；另一方面，铁也可能参与Fenton反应，促进ROS生成，从而增加氧化应激和产品颜色风险。

因此，看到黄色或黄褐色DS时，不应只问“颜色能不能去掉”，而要进一步追问：

• 是否存在Trp氧化升高？
• 是否存在高铁培养基或铁源差异？
• 是否有光照、ROS或长期高密度培养带来的氧化压力？
• 颜色变化是否伴随酸性变异体增加？

在CHO细胞培养过程中，还原糖或碳水化合物降解产生的二羰基副产物，可与蛋白质赖氨酸、精氨酸或N端氨基发生非酶促反应，逐步形成AGE。部分AGE产物具有可见光区吸收或荧光特征，可能导致蛋白呈现黄色至棕黄色。

有研究通过质谱分析不同颜色强度的CHO来源重组抗体，发现多个AGE修饰与产品颜色呈强相关，其中CML（ε-羧甲基赖氨酸）进一步通过ELISA得到验证，提示AGE至少部分参与了CHO来源抗体的颜色形成。

这意味着，颜色分析不能只停留在“氧化”一个维度。对于高糖补料、长周期Fed-batch、高密度培养或糖代谢压力较大的项目，应同时考虑：

• 还原糖暴露时间
• 补糖策略与残糖水平
• AGE或CML水平
• 酸性变异体变化
• 氧化与糖化是否存在协同效应

培养基中的维生素B12（钴胺素）存在多种形式，其中氰钴胺（CN-Cbl）最稳定，而羟钴胺（OH-Cbl）则被认为是导致蛋白显色的关键分子。研究表明，培养基中的CN-Cbl在光照条件下会逐渐转化为OH-Cbl，而OH-Cbl能够与蛋白发生结合，从而赋予产品粉红色外观。

这解释了一个常见现象，培养阶段看起来正常，但培养基、补料或中间体经历光照暴露后，最终产品可能出现发粉。

需要注意的是，

仅有VB12或仅有OH-Cbl本身并不一定导致产品发粉。Derfus GE等2014研究发现，粉红色形成还需要另一个重要条件——抗体发生二硫键还原。只有当“还原态抗体”和“羟钴胺（OH-Cbl）”同时存在时，最终产品才会呈现典型的粉红色。

因此，除了培养基成分之外，Harvest过程同样是颜色控制的重要环节。

对于VB12相关颜色风险，重点不是简单地问“培养基里有没有B12”，而是要问：

• B12以什么形式存在？
• 培养基和补料是否避光？
• 是否存在CN-Cbl向OH-Cbl转化？
• 收获后体系是否长期处于强还原环境？
• 细胞破裂是否增加？

结果1

铁离子浓度升高导致DS颜色逐渐加深。如图5所示，在10 μMFe条件下，DS呈现浅黄色；随着铁浓度增加至20、30、50及110 μM，颜色逐渐加深，由浅黄色向浅棕色转变，提示铁离子水平与产品显色风险呈正相关。虽然铁离子并非直接显色物质，但其诱导的ROS积累可促进Trp氧化，进而形成Kyn和NFK等有色降解产物。

长期低铁适应恢复细胞生长和表达能力。如图6，直接降低铁离子虽然能够改善颜色，但研究人员发现，早期低铁工艺（Process A）会出现活细胞密度（VCD）降低和蛋白表达量（Titer）降低的现象，因此研究团队进一步采用长期低铁适应策略，让细胞在20 μM铁离子条件下连续传代至P20。结果显示，Process B在保持较浅DS颜色的同时，VCD和Titer恢复至接近高铁工艺水平。

1. 直接降低铁离子可以改善颜色，但可能牺牲细胞生长和表达。

2. 长期低铁适应可帮助细胞在低铁条件下恢复较好的生长和生产能力。

3. 颜色控制必须与VCD、Titer、charge variants和其他CQA联合评估。

如图7，研究人员比较了正常收获条件（C-HCCF）和促进还原条件（RP-HCCF）下的产品颜色变化。结果显示，即使培养基中含有相同浓度的VB12，只有在发生二硫键还原的条件下，最终产品才出现明显粉红色。这说明VB12本身并不是唯一决定因素，真正的发粉机制是培养基中的VB12与收获阶段二硫键还原共同作用。

2. 胞内还原体系释放；

3. 抗体二硫键还原；

4. 蛋白构象或结合位点暴露；

5. OH-Cbl与蛋白结合；

6. 最终DS呈现粉红色或红色。

• 缩短Harvest Hold
• 降低过滤剪切和压力
• 控制收获液温度和DO
• 监测LDH或细胞破裂指标
• 监测完整抗体比例
• 必要时评估通气或氧化还原调控

它更像是培养体系、培养基组成、氧化还原状态和分子修饰共同留下的工艺指纹。

对于上游工艺开发人员而言，颜色真正值得关注的，不只是“这一瓶是不是更黄、更粉”，而是它背后提示了什么：

• 是否有ROS升高？
• 是否有Trp氧化或AGE增加？
• 是否存在VB12/OH-Cbl结合？
• Harvest阶段是否发生二硫键还原？
• 培养基组分是否需要重新平衡？
• 颜色变化是否伴随其他CQA变化？

相比在下游阶段尝试“去除颜色”，更有效的策略往往是在上游和Harvest阶段提前预防：优化培养基组分、控制ROS、管理光照暴露、降低糖化风险，并稳定收获阶段氧化还原环境。

当蛋白原液开始变黄、变棕或发粉时，它提醒我们的可能不是一个外观问题，而是一条值得追踪的工艺线索。

延伸阅读：见本期另一篇文章《同样是VB12，为什么供应商A和B颜色不同？》，本文进一步通过VB12供应商对比案例，分析原材料粒径、晶型及颜色差异对培养基外观的影响。