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从短链到长链：核酸药物水相纯化工艺的放大新思路

8 月 19, 2026

近年来，核酸药物已成为生物制药领域备受关注的方向之一。从反义寡核苷酸（ASO）、siRNA，到mRNA、saRNA以及基因编辑所需的长链向导RNA（gRNA），越来越多创新疗法正进入临床和商业化阶段。

随着适应症不断拓展、生产规模持续放大，核酸药物纯化工艺也在从“实验室可行”向“可工业化放大”快速演进。

对于工艺开发团队而言，建立高效、稳健且可放大的纯化平台，已成为推动项目从研发走向产业化的关键环节。

PART. 01 序列长度对寡核苷酸纯化工艺有较大影响

寡核苷酸通常通过固相逐步偶联合成。随着序列长度增加，每一步偶联效率的累积影响会逐渐放大，导致失败序列、截短体及其他产品相关杂质比例升高，纯化难度也随之增加。

对于20至25 mer左右的常规寡核苷酸，一步阴离子交换层析通常可以获得较好的分离效果；而对于更长链的寡核苷酸，分子结构、二级构象以及杂质相似性会进一步增加分离难度，往往需要更具选择性的捕获和精纯组合工艺。

PART. 02 阴离子交换平台，为寡核苷酸纯化提供了更稳健的工艺路径

传统寡核苷酸纯化主要依赖阴离子交换色谱（AEX）或反相色谱（RPC）。其中，反相色谱分离能力较强，但通常需要引入有机溶剂；相比之下，阴离子交换色谱更适用于水相体系，易于放大，并可通过盐梯度实现全长产物与相关杂质的分离，已成为寡核苷酸纯化中的重要平台技术。

以Capto Q ImpRes为代表的强阴离子交换介质，适用于20至25 mer寡核苷酸的高分辨率纯化；对于更长链的DMTr-on寡核苷酸，则可采用Capto PlasmidSelect进行前段富集，再结合Capto Q ImpRes精纯，形成兼具选择性与放大潜力的水相纯化组合工艺。

短链寡核苷酸纯化：一步Capto Q ImpRes层析+TFF超滤

在21-mer DNA寡核苷酸研究中，比较三种阴离子交换填料：Capto Q ImpRes、SOURCE 30Q和Capto adhere ImpRes的不同表现。如下表：

填料	DBC，QB10	纯度
Capto Q ImpRes	34 mg/mL	99
SOURCE 30Q	20 mg/mL	94
Capto adhere ImpRes	41 mg/mL	97

表1：不同填料在纯化21-mer DNA载量和纯度

综合载量，纯度，使用Capto Q impRes在ÄKTA pilot 600上进行放大规模纯化，纯度可达95%以上，收率86%。

图1：Capto Q impRes纯化粗寡核苷酸层析图谱（设备ÄKTA pilot 600，载量27 mg/mL，将样品使用10 mM NaOH稀释10倍，使用线性梯度从7.5%B到72%B洗脱，梯度长度为15 CV，A液和B液分别对应10 mM NaOH和1 M NaCl。洗脱液按每1升收集，总共收集了15个分馏，并通过HPLC分析全长产物纯度。使用绿色收集策略可获得纯度在95%或以上的最佳回收率）

图2：Capto Q impRes在不同收集策略中的收率和纯度

Capto Q ImpRes在短链RNA寡核苷酸纯化中同样具有良好表现。以21-mer RNA为例，固相合成粗品纯度约为85%，经脱盐后在25 mM Tris、pH 9.0条件下上样，载量为37 mg/mL，约80%DBC。通过盐梯度洗脱和分管收集，最终获得约86%回收率和约94%至95%纯度，这也表明Capto Q ImpRes在短链RNA寡核苷酸纯化中兼具较好的载量、分辨率和放大性。

图3：HiScreen Capto Q ImpRes纯化R21-mer RNA层析图谱。（设备ÄKTA pure 25，上样量175 mg，采用25 mM Tris、1 M NaCl、pH 9.0的15 CV线性盐梯度洗脱）

图4：不同收集管下RNA的收率和纯度

长链核苷酸纯化工艺：Capto Plasmid+Capto Q impRes

与短链寡核苷酸相比，长链分子在化学合成过程中更容易累积失败序列。单纯依靠一步阴离子层析很难达到纯化目的，因此，Cytiva先利用Capto PlasmidSelect选择性富集DMTr-on全长产物，再通过Capto Q ImpRes进行抛光。

整条工艺路径为：粗合成产物脱盐和条件调整→Capto PlasmidSelect捕获DMTr-on全长产物→低pH脱三苯甲基→脱盐→Capto Q ImpRes阴离子交换。

寡核苷酸化学合成中，5’端二甲氧基三苯甲基保护基，常称DMTr，可作为区分全长合成产物和部分失败序列的重要标签。全长产物若保留DMTr基团，疏水性与未带DMTr的失败序列不同，因此可以利用特定介质进行选择性分离。

其中Capto PlasmidSelect配基基于特殊的嗜硫芳香吸附选择性，且DMTr-on 全长寡核苷酸由于保留三苯甲基保护基，具有更明显的疏水和芳香结构特征；

在高硫酸铵条件下，这种差异被进一步放大，使其能够与 Capto PlasmidSelect 发生选择性吸附，而 trityl-off 失败序列主要进入流穿。

在84-mer寡核苷酸研究中，粗合成寡核苷酸先被脱盐并稀释至50 mM Tris、1.75 M硫酸铵、pH 7.5条件。带有DMTr的全长产物通过Capto PlasmidSelect与未带DMTr的失败序列分离；失败序列主要出现在流穿中，三苯甲基保护的全长寡核苷酸则随后通过线性梯度洗脱。纯化后，纯度从36%提升至81%，总收率69%。

图5：Capto PlasmidSelect纯化84-mer寡核苷酸层析图谱（柱子: HiScreen Capto PlasmidSelect，载量10 mg /mL , RT：6分钟。洗脱在相同流速下进行，采用20 CV到50 mM Tris，pH 7.5的线性梯度，并收集成 2 mL的分段。各收集分段的纯度以绿色显示，右侧y轴标注了纯度百分比)

对Capto PlasmidSelect捕获后的料液进行脱三苯甲基反应。随后样品通过脱盐柱置换至10 mM NaOH、pH 12条件。脱三苯甲基后的84-mer寡核苷酸进一步使用Capto Q ImpRes进行精纯。再结合洗脱模式下，寡核苷酸纯度提高至98%，单步收率81%。

图6：Capto Q ImpRes纯化84-mer寡核苷酸层析图谱（柱子: HiTrap Capto Q ImpRes，上样RT：1分钟。洗脱RT：6 min，使用50% B到100% B的线性梯度，洗脱缓冲液为1 M NaCl, 10 mM NaOH, pH 12，收集体积分为0.8 mL）

84-mer寡核苷酸纯化各步骤纯度和回收率如下：

工艺步骤	步骤回收率	总回收率	纯度	pH
脱盐后粗产物	N/A	N/A	36%	7.5
Capto PlasmidSelect	69%	69%	81%	7.5
脱三苯甲基和脱盐	94%	65%	90%	<4
Capto Q ImpRes	81%	53%	98%	12