文献速递丨MAM引领Protein A填料全生命周期管理新纪元

在单克隆抗体（mAb）药物的商业化生产中，Protein A亲和层析填料一直是不可或缺的核心耗材。然而如何准确评估填料的状态、寿命和清洁效果，长期以来困扰着广大药企。

2026年3月，礼来（Eli Lilly and Company）研究团队发表了一项开创性研究，首次将多属性方法（Multi-Attribute Method, MAM）系统性地应用于Protein A填料分析，为填料的全生命周期管理提供了全新的分子级视角^【1】。

Protein A亲和层析填料在生物制药生产中被广泛用作单克隆抗体以及Fc融合蛋白纯化的首要捕获步骤^【2】，目前全球已有超过200种治疗性抗体上市，同时还有1000多种候选药物正在接受评估^【3】，2024年全球治疗性抗体市场规模约2500亿美元，预计到2029年这一数值将翻倍至5000亿美元^【4】。然而，Protein A亲和填料也是单克隆抗体药物生产中最大的成本因素之一，当生产规模的Protein A层析柱直径超过100 cm时，填料支出可能超过百万美元^【5】。

Cytiva作为行业领先的供应商，MabSelect系列填料涵盖了从经典到工程化改造配基的完整产品线，其中MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX和MabSelect PrismA这四款Protein A填料是本次礼来团队的核心研究对象。研究用的填料样本不仅涵盖了完全未使用的全新填料，还收集了来自礼来工业制造管线中历经112至291次实际纯化周期的旧填料。

Protein A填料污染主要源于进样料液中成分的非特异性吸附，包括宿主细胞蛋白（HCP）、单克隆抗体聚集物或片段、以及其他杂质在颗粒表面及内部的累积，从而堵塞孔道并限制与配基的接触^【6】。

传统研究Protein A填料的污染和降解需要借助颗粒分析、HPLC、荧光光谱、SDS-PAGE、电子显微镜等多种技术平台进行组合拳式评估，不仅费时费力，且难以获得分子层面的完整信息。以往用于蛋白质结构表征的MAM技术通过将液相色谱与高分辨率质谱联用（LC-HRMS），能够在单次分析中同时获取填料身份鉴别、配基完整性、化学修饰、残留杂质、清洁效果等多个关键质量属性（CQA）^【7】。

MAM方法被用于填料全生命周期管理的三个关键方面：

• 确认Protein A配基的身份
• 识别与污染和清洗相关的化学修饰，以指导合适的CIP策略
• 评估使用后填料上残留的mAb和HCP污染

在GMP生产中，由于同时使用多种具有不同配基和基质的填料，需要一种可靠的识别方法以防止标签错误或交叉污染。尽管傅里叶变换红外光谱（FTIR）、配基密度测量和结合能力分析等技术较为常见，但这些方法往往缺乏用于准确鉴定填料所需的特异性。

作为更有效的替代方法，MAM通过利用Protein A配基独特的氨基酸序列，使用胰蛋白酶酶解并结合C18反相液相色谱与高分辨率质谱分析，可生成特异性的肽段图谱，这种“分子指纹”能够可靠地确认不同类型的填料身份（图2）。

从图2中可以看到，未经改造的MabSelect填料保留了天然Protein A的五个免疫球蛋白结合域（E、D、A、B、C domain），其肽段图谱最为复杂；而MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX填料采用重复Z结构域的工程化改造配基，图谱相对简洁且完全相同。值得注意的是，尽管这两款填料配基序列一致，但MabSelect SuRe LX的总峰面积更高，实现了分析层面的明确区分。

在Protein A亲和层析纯化抗体过程中，循环经历上样、冲洗、洗脱以及高pH CIP操作会使Protein A填料长期暴露于多重化学应力之下，这些条件容易诱发蛋白配基发生氧化、脱酰胺与断裂等修饰，继而削弱配基的完整性与填料性能。

礼来研究团队对三组新、旧Protein A填料进行了MAM对比分析，其中来自礼来工业制造管线的3款旧填料：MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX分别历经了116次、291次、112次的实际纯化周期（表1）。

与全新填料相比，使用过后的MabSelect填料表现出整体信号强度的降低，而图3中黑色箭头所标示出的MabSelect填料肽段明显缺失，很可能是由于反复暴露于酸性洗脱和碱性清洗条件下导致的配基裂解所致。

MAM分析进一步展示了MabSelect SuRe填料在历经近300次纯化循环后，肽段图谱和新填料近乎相同，这得益于MabSelect SuRe工程化改造配基所增强的碱性降解抗性。图4中多个肽段位点表现出天冬酰胺脱酰胺（3′, 4′, 5′）和天冬氨酸异构化（3′′,5′′），这两类现象均对pH波动极为敏感，这表明即便是耐碱Protein A配基在重复低pH洗脱与高pH CIP循环过程中仍然容易受到累积性化学修饰的影响。

宿主细胞蛋白（HCPs）是在单克隆抗体生产过程中引入的工艺相关杂质，可能影响终产品的安全性和有效性，传统检测方法例如ELISA和LC-MS方法只能检测洗脱液中的可溶性杂质，而吸附在填料表面的杂质往往被忽略，仍与Protein A配基强结合的HCPs和残余的mAbs可能无法被常规流程捕获^【8】。

MAM最令人兴奋的应用在于其能够直接检测残留在填料基质上的mAbs和HCPs，MAM方法直接对填料进行酶切分析，彻底解决了这一盲点。礼来研究团队为评估杂质累积情况，对三种填料MabSelect、MabSelect SuRe 和 MabSelect SuRe LX 进行了MAM分析，检测结果如表2所示。

对于未经改造的MabSelect填料，历经116次纯化循环后不仅含有大量的目标MAB1残留，且检测到了多种不同HCPs，包括肌动蛋白以及血小板应答蛋白TSP-1等。相比较之下，经过291次纯化循环的MabSelect SuRe仅残留0.38%的MAB2，同时HCPs也低于系统检测限，这充分体现出工程化改造配基在抗杂质积累和可清洁性方面的显著优势。

值得注意的是，尽管MabSelect SuRe LX在112次纯化循环后的HCPs 低于系统检测限，但是残留MAB3含量却远高于近300个纯化循环的MabSelect SuRe填料，这极大概率是由于采用不同CIP策略导致的：MabSelect SuRe填料采用了0.1 M NaOH和1 M醋酸的交替清洗，而MabSelect SuRe LX仅仅采用了0.05 M NaOH+1 M NaCl的低浓度碱洗（表1），碱液浓度的降低使得填料表面残留mAb的富集趋势更为明显。

基于LC-MS的MAM分析可同时定量Protein A填料上残留的mAbs和HCPs，并在反复使用后对化学修饰进行图谱分析，从而提高工艺监测和故障排查的灵敏度和特异性。

礼来团队的研究首次将MAM从蛋白的表征领域拓展到填料分析，建立了一个填料全生命周期管理的新体系。随着下一代Protein A填料向更高结合能力、更高配基密度和更强耐碱稳定性持续进化，能够解析细微分子变化的高级分析工具将变得日益关键。

MAM应用在未来无疑将为生物制药行业的填料选择、清洁优化和生命周期管理提供前所未有的精准洞察，助力更稳健、更高效、更可持续的下游工艺开发。