优化细胞疗法工艺——细胞解冻指南

研究发现，在低于-120 °C下冷冻保存治疗药物可在细胞库中实现稳定、长期的储存，直至需要治疗为止。^1–3

冷链管理包括三个关键阶段：

1. 冷却
2. 存储*
3. 解冻^1,3–5

对于临床细胞系统，前两个阶段通常使用经过验证的方案和自动控速冷冻机进行精确控制和记录。^1,6对于临床细胞系统，前两个阶段通常使用经过验证的方案和自动控速冷冻机进行精确控制和记录。^1,7

高效解冻对细胞活力和性能影响最小，是流程的关键环节，通常是在即时诊断进行的最后操作。此类治疗有可能挽救生命，但如若在解冻过程中出现错误，可能影响治疗效果，从而对患者造成严重影响，同时给产品开发者带来高昂成本和声誉受损。^1,5,8,9冷冻保存和解冻在工作流程的多个步骤发生（图 1），应尽可能减少由这些过程造成的任何有害影响。

临床现场并不总是有专门的技术人员进行解冻，特别是当为了降低风险而需要分多次剂量（多个冷冻袋）进行治疗时。因此，在患者现场解冻越来越多地由临床工作人员进行，而这些人员可能缺乏冷冻保存的培训和经验，¹¹从而增加处理不当的风险、降低细胞活力并损害治疗效果。

尽管水浴在研究环境中已经足够，但在临床和洁净室环境中却存在固有困难。除工艺和产品变化的风险外，温水还会带来受控环境下不可接受的污染风险。^12–14还需具备用于灭菌、复温、再填充和温度稳定的时间和设施。

为应对这些限制，能够处理冷冻袋中较大样本量的无水解冻装置逐渐受到青睐。^1,5,15–18这些系统消除了使用者间差异，提供一致且可编程的流程，最大限度减少使用者主观干预，包括计算机控制、监测和数据记录等选项。研究表明，干式解冻也可成功应用于非细胞治疗材料（如血浆）^1,15–18，从而进一步推动了这些设备的广泛应用。

1、控制冷却以实现稳定解冻：

• 缺乏积极研究：关于哺乳动物体细胞的最后一项系统性研究发表于1979年，距今已超过30年。²²同一时期关于冷冻保存精子升温速度的论文至少有6篇，关于冷冻保存胚胎升温速度的论文至少有5篇。
• 对现有数据的误用：人们一直认为精子和胚胎的数据可转化用于体细胞。
• 解冻后延迟清洗细胞：DMSO毒性可在DMSO被洗掉之前损害解冻后的细胞。一些程序将细胞的物理升温与清洗视为一个“解冻”步骤。延迟清洗有时会与缓慢解冻相混淆。

在实验室中，约2至3分钟的湿解冻过程操作便捷；然而，当解冻以精确控制速率冷却的体细胞时，不需要这种快速方法。研究人员已针对多种细胞类型测试了缓慢冷却后较慢的升温速度，结果表明，对肝细胞23、神经细胞24、神经细胞4、神经细胞25、L 细胞22、未处理的单采血样5和淋巴细胞26的解冻后结果均无影响。令人惊讶的是，尽管普遍认为快速升温有利，但尚无研究表明细胞治疗过程/免疫疗法需要快速解冻。

人们通常认为，为防止冰在升温过程中重新结晶，需要快速融化。上述研究表明，只要适当控制冷却，无论升温速度如何，冰都不可能重新结晶。

2、冷却过程中的冰晶形成：

当冷却速度过快时，可能会出现问题，包括细胞损伤。⁴快速冷却后，水分子没有足够的时间附着到冰晶上或从细胞中流出。当温度达到玻璃化转变温度（约-120 °C）且不再可能发生分子运动时，晶体会以悬浮状态存在，结构不稳定。³然后，当系统升温并于解冻时重新引入热量，水分子开始再次附着于冰晶。²⁸这一现象称为重新结晶，会对细胞施加显著渗透压力并导致损伤。

幸运的是，冷冻保存细胞疗法和哺乳动物体细胞所需的缓慢冷却速度（每分钟最高几度）可形成热力学稳定的冰晶，从而无需快速升温。⁴这一过程可在不同冷却速率下冷却和解冻时通过低温显微镜在冰晶上观察到（图 2），并且已发现与细胞回收结果相关。

不同体积的冷冻袋样本以-1 °C/min 左右的速率进行干式解冻，虽可能比传统水浴解冻耗时更长，但可获得相当的解冻后细胞产量，并消除水浴湿式解冻带来的不一致风险。

3、解冻后毒性：

解冻后冷冻保护剂的毒性在冷冻保存周期的所有液相阶段均具有相同的破坏潜力，但常被忽视。由于细胞已受到冷冻/解冻周期的应激，因此在解冻时对冷冻保护剂毒性的敏感度至少与在冷却时同样敏感，甚至更敏感。^30–32一定的缓冲时间仍可接受，但因产品而异。例如，市售Kymriah和Yescarta CAR-T疗法的制造商建议，在室温（20 °C-25 °C）下将细胞在冷冻保护剂中解冻后，分别在不超过30分钟和3小时内将细胞输注到患者体内。^33–34这一时间限制包括输液期间的任何中断时间，有助于确保维持最大细胞活力。

在水浴中解冻时间过长可能对细胞回收产生不利影响，因为水的高热传导性会使样本迅速升温至37 °C。这种快速升温过程会在袋内产生较大温度梯度——部分区域（尤其是接头周围）可能仍残留小冰晶，而其他区域已达到水浴温度。湿式解冻的缓解策略包括在加热过程中搅动袋子，并在所有冰融化之前将其从水浴中取出。然而，此类措施因使用者而异，且容易出现样本和批次间差异。干式解冻系统通过自动化和更慢的解冻速度，有助于减轻细胞冷冻保护剂损害并提高解冻过程间的一致性。

坏死性死亡包括在冷冻保存过程中立即杀死的细胞（在大多数细胞活力检测中显示为解冻后膜通透性细胞），以及从系统中完全丢失的细胞，无论是通过洗脱步骤还是完全裂解。这些“缺失”的细胞通常不会出现在活力检测中，因为它们已从系统中去除，但可以通过冷冻前和解冻后的细胞数量差异检测到。^35–36

解冻后台盼蓝染色检测快速、简便、成熟且成本低廉。³⁷该染料有助于确定细胞膜通透性，这与细胞死亡密切相关；然而，功能性死亡的细胞在检测时仍可能保持完整膜结构，从而导致假阳性结果。³⁶台盼蓝也可用于细胞计数，以确定真实的活细胞数量。³⁶

更复杂的检测方法包括增殖检测、凋亡标志物检测以及针对细胞在体内预期用途的功能性测定，例如NK或T细胞靶向作用于表达特定标志物癌细胞的能力。³⁵理想情况下，细胞活力和活性检测应在患者给药前进行，但在临床中这通常难以实现。因此，必须充分了解即时活力检测的局限性。

在评估解冻后的细胞活力时，务必确保使用适当的检测方法，同时考虑这些检测方法的稳健性以及治疗实用性。