PBMC分离中的变异性控制与工艺优化

在再生医学和细胞治疗领域，输血中心通常利用白细胞分离术获取白细胞（如淋巴细胞、单核细胞和干细胞等），这些细胞可作为体外工程化患者特异性细胞疗法（即自体治疗）的起始材料。

• 动员型血液成分分离术的目标是获取造血干细胞（HSC）。在采集前，患者或捐献者需要接受预处理，以促使HSC从骨髓动员至外周血。
• 非动员型血液成分分离术则无需预处理，主要用于获取已分化细胞，例如B细胞、T淋巴细胞或单核细胞。这类患者特异性源材料，是免疫治疗开发的重要起始原料。

尽管源产品本身存在差异，但在免疫疗法制造中，开发一套灵活且适用于不同患者的工艺，仍然是一项重要挑战。与血液成分分离相关的关键变量包括：

• 患者特定变量，例如年龄、民族和诊断
• 所用血液成分采集设备的性能
• 运输和储存条件，例如缓冲液和温度
• 单采血液产品处理后的血液成分变异性

其中，一部分变量可以通过标准化加以控制，而另一些与患者个体相关的因素则较难干预。通过合理的工艺控制策略，可以尽可能降低患者固有差异带来的影响，从而获得更可预测、更一致的细胞治疗产品，并提升治疗的安全性和有效性。

运输和储存条件

完成血液成分采集后，细胞制品通常需要储存，并从中央处理中心运输至后续处理地点。如何在不同地点之间建立合适的储运条件，是维持高细胞活力的关键。过去几年，已有多项基于健康志愿者的研究，对通过血液成分分离术获得的非动员型单核细胞（MNC）进行了分析，以确定更优的储存条件。

这些研究揭示了以下内容：

• 冷藏储存（4 °C至8 °C）比室温 (RT) 储存（20 °C至22 °C）更能保持细胞活力，尤其是对于细胞浓度较高的产品。
• 高细胞浓度下室温保存会导致白细胞相对减少。
• 在许多血液成分分离程序中观察到血小板活化，诱导单核细胞与血小板聚集。

总体来看，建议在各项流程中使用统一的采集设备，并在4 °C条件下储存和运输血液成分分离制品，以更好地维持细胞活力、数量和表型稳定性。

细胞含量异质性和MNC富集

在这一富集阶段，单个核细胞（如单核细胞和淋巴细胞）会依据不同组分的密度，与血小板、血浆、红细胞和粒细胞（GRC）分离。常用方法是采用密度梯度分离培养基，例如Cytiva的Ficoll-Paque。其密度为1.077 g/mL，位于红细胞和粒细胞与单个核细胞、血小板、血浆之间，可在离心后实现不同组分的有效分层：高密度细胞位于底部，低密度血浆和血小板位于顶部（图3）。

其中，去除红细胞尤为关键。红细胞污染可能使最终细胞治疗产品呈红色，监管机构可能将其视为杂质，进而影响产品合规性。若能在早期同步去除血浆和血小板，还可减少血小板活化，从而更有利于清除其他非目标细胞。活化的血小板可能附着在其他细胞表面并形成聚集体，改变细胞密度，进而影响密度梯度分离效率。

已知可能诱导血小板活化的因素还包括：高细胞浓度、储存时间过长、缺乏钙螯合剂、采集装置类型以及离心过程中的较强机械力。

历史上，MNC富集过程的前几步包括：

• 输入产品的浓缩
• 通过密度梯度培养基去除红细胞

但在实际操作中，这一流程有时会带来以下问题：

• 血小板附着于单核细胞（聚集形成）
• 单核细胞活力下降
• 红细胞污染（通过评估最终产品的颜色判断）

通过分析红细胞污染程度（表现为终产品偏红）与初始血液成分分离样本特征（如细胞组分再分布）之间的关系，我们提出了以下假设：

红细胞污染可能与输入血液成分分离制品的血小板含量相关

在红细胞分离前去除血小板有助于避免血小板活化，从而避免血小板聚集和影响红细胞分离的效率

基于这些经验，我们认为血小板计数在富集流程早期阶段起着关键作用。较高的血小板计数会干扰红细胞分离效果，因此建议在流程早期尽量降低并标准化血小板水平。

为验证这一判断，我们进一步开展了一项研究，重点评估在红细胞分离前先降低血小板计数所带来的收益。研究主要比较了以下两种方案：

去除血小板后
分离红细胞的MNC富集效率

直接对高血小板浓度的产品
进行红细胞分离的MNC富集效率

结果表明，越早去除血小板，越有助于降低密度梯度分离过程中的红细胞污染；这一效果在初始产品血小板含量较高时尤为明显。

其他注意事项：

• 血液成分分离术的白细胞浓度会影响红细胞分离的有效性。除了血小板计数外，初始血液成分分离制品中的白细胞浓度也会影响红细胞分离的成功率。随着白细胞浓度增加，红细胞污染的风险也随之升高。对于初始白细胞浓度高于80至100×106个细胞/mL 的血液成分分离样本，您不太可能使MNC富集产品的血细胞压积明显低于1%（图4）。

• 不同采集中心提供的血液成分分离制品可能具有不同特性。根据我们的直接经验，血液成分分离术提供商拥有不同规模的捐献者群体，且采集产品的频率各不相同。一般而言，采集频率越高，捐献者材料中活化血小板数量就越多。

此外，缓冲液的选择也会影响细胞聚集风险。在血液成分分离制品的运输和洗涤过程中，使用含钙螯合剂的缓冲液（如EDTA）可减少白细胞表面附着的血小板比例，从而降低细胞聚集体对红细胞分离效率的负面影响（图5）。在相关研究中，样本来自健康捐献者，室温运输并在24小时内送达，随后通过流式细胞术检测血小板活化标志物（P-选择素/CD62P）。结果显示，若未使用EDTA（钙螯合剂），血小板难以被有效洗脱。

• 红细胞压积（Hematocrit, HCT）：不应超过 55%。当HCT极低（<1%）时，由于产品高度透明，可能导致仪器过早判定为“空袋（empty bag）”，从而只完成部分处理。
• 初始总有核细胞浓度（TNC, Total Nucleated Cell）：不应超过100×10⁶ /mL。
• 总细胞体积（Total Cell Volume）：不应超过初始产品体积的60%。
• 产品粘度（Product Viscosity）：粘度过高可能降低细胞沉降效率。
• 凝块或细胞聚集（Clots or Aggregates）的存在：会对沉降过程以及基于光学的细胞检测产生不利影响。
• 产品时效（Product Age）：超过72小时或储存不当的样品，可能无法正常处理。
• 温度敏感性（Temperature Sensitivity）：若产品温度过高，可能会对下游工艺（如DGM分离）产生负面影响。