实验室切向流系统-病毒纯化实战指南

5 月 15, 2026

本篇结合真实研究案例，带你快速厘清：

切向流过滤（TFF）到底解决了传统离心/沉淀的哪些问题？
慢病毒纯化中，滴度、背景值、转导效率如何同时兼顾？
在 VLP、AAV等体系里，TFF应该怎么用才“真的有效”？
实验室阶段，是否有不依赖大规模设备的TFF方案？

典型的病毒载体生产遵循”细胞扩增→病毒包装→收获澄清→浓缩纯化→质量放行”的五步闭环。在收获澄清，浓缩纯化工艺中，Cytiva实验室过滤产品针对不同样品体积有高针对性的解决方案。

切向流过滤原理

切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF）是一种使料液沿膜表面平行流动的过滤技术，溶质在跨膜压力驱动下实现分离。与传统直流（死端）过滤相比，TFF可有效减少颗粒在膜表面的堆积与堵塞，维持稳定通量，适合高浓度、大体积样品的连续处理。同时，TFF兼具浓缩与置换缓冲液（透析）功能，过程温和、剪切力低，更有利于保持病毒、蛋白等生物大分子的结构完整性与生物活性，因而在生物制药和病毒载体纯化中优势显著。

直流过滤示意图

切向流示意图

切向流在慢病毒纯化中的应用

接下来让我们通过慢病毒纯化中切向流的应用案例，看看它是如何实现效率革命的。

罗格斯大学Parekkadan团队对比研究了各种纯化方法的效率差异。他们采用两种不同的转染规模（10厘米培养皿和HYPERFlask）来评估不同的纯化方法:蔗糖梯度、LV浓缩器以及切向流过滤（TFF）。下游阶段,根据两个参数 — 病毒滴度和Gaussia Luciferase（Gluc）背景值 — 来判定纯化前后的纯化效率。最后,通过利用HEK-293T细胞进行病毒转导的方式,对病毒在纯化前后的功能及完整性进行了测定。所有应用中均使用Lentiviral vectors，这些载体表达一种分泌型外游基因Gluc和一种荧光标记物。

图1. 不同纯化方法在降低转基因表达背景方面的纯化效率评估（Bento et al., 2025） (A) 采用10 cm培养皿转染进行蔗糖梯度纯化，并进行病毒滴度测定；(B) 在纯化前后测定GLuc背景信号（n = 6）。(C) 使用市售慢病毒浓缩试剂盒对HYPER Flask批次样品进行浓缩，并进行病毒滴度测定；(D) 在纯化前后测定GLuc背景信号（n = 6）。(E) 另一组6个 HYPER Flask® 批次重复样品采用切向流过滤法进行纯化，同样进行病毒滴度测定；(F) 在纯化前后测定GLuc背景信号。(G) 计算各组中病毒滴度和GLuc背景参数的百分比下降幅度，并进行统计学显著性分析。(H) 纯化比率定义为GLuc背景降低幅度与病毒滴度降低幅度之间的比值，用于各组比较。柱状图表示各组的平均值 ± 标准差。*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001，双因素方差分析（two-way ANOVA）。

在分泌型转基因Gluc背景清除实验中，Minimate EVO切向流系统搭配100 kDa膜包实现>90%的转基因背景削减，病毒滴度损失<15%，而蔗糖梯度超速离心损失约33%，商用慢病毒浓缩试剂盒损失高达87.5%。转导效率方面，TFF纯化组同等MOI下，RFP阳性细胞率显著高于未纯化组——证明杂质清除直接提升了病毒的有效感染能力。

图2. 切向流过滤（TFF）纯化后病毒效力与有效性的评估。（Bento et al., 2025）(A) 采用来自 HYPERFlask® 转染批次的纯化或未纯化病毒，以递增剂量处理HEK‑293T细胞。处理后72 h对细胞进行成像；(B) 定量分析各组的RFP荧光信号（n = 3）。(C) 在转导后72 h收集细胞上清，并检测其GLuc活性。各组的GLuc分泌量进行了定量分析（n = 3）。柱状图表示各组的平均值 ± 标准差。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，双因素方差分析（two-way ANOVA）。

其他病毒纯化场景中的切向流应用

TFF在处理慢病毒样品时展现了良好的纯化效率，同样适用在类病毒颗粒（VLP），腺相关病毒（AAV）浓缩纯化中。

柏林Charité大学开发的SARS-CoV-2 VLP平台展示了TFF在疫苗级纯化中的放大潜力。Expi293稳定细胞系经多西环素诱导后，上清经2000 ×g澄清、0.45 μm过滤，进入Minimate EVO切向流系统（300 kDa Omega膜，孔径约35 nm，Pall/Cytiva），以0.124–0.165 kPa跨膜压、135 rpm流速进行连续洗滤（4倍体积PBS置换）。纳米颗粒追踪分析（NTA）证实颗粒直径稳定在107–111 nm，与真实病毒一致。

图3.切向流过滤结合PEG沉淀可提高SARS‑CoV‑2病毒样颗粒（VLP）的纯度及特异蛋白含量。（Hirschberg et al., 2023）(A) VLP纯化流程示意图。(B) 在纯化流程中，来自三个独立批次的不同样品进行分析型凝胶过滤的代表性洗脱曲线及其紫外（UV）定量分析，其中标出了VLP峰和非特异性峰。(C) 纯化流程中不同样品的粒径分布（附加图见图 S1）以及(D) 相应的定量分析结果。(E) Western blot显示来自三个独立批次VLP中刺突蛋白（Spike）和核衣壳蛋白（Nucleoprotein）的存在情况（完整膜图见图 S2）。*p < 0.05，**p < 0.01。

TFF常用于浓缩AAV，但残留宿主细胞蛋白（HCP）易与病毒颗粒形成聚集体，东京大学Okada团队2023年发表于Biotechnology and Bioengineering的研究在TFF前加入0.5%脱氧胆酸钠（阴离子表面活性剂）+1% CHAPS（两性离子表面活性剂）的协同处理，利用二者对不同HCP群体的解聚作用，在AAV有效浓缩的同时，实现了99.98%的HCP清除率和95%的DNA清除率。

图4. 无表面活性剂条件下的TFF纯化。（Miyaoka et al., 2023）采用以下方法对腺相关病毒1型（AAV1）载体进行分析：(a) 12%（v/v）十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‑PAGE），并使用Oriole荧光凝胶染料进行染色；(b) 透射电子显微镜（TEM）观察。在 (a) 中，M表示蛋白分子量标准；SM表示起始材料（TFF前）；泳道1表示TFF后样品；泳道2表示经100 kDa膜包浓缩后的TFF后样品。在 (b) 中，对经浓缩后的TFF后样品进行分析。黑色箭头表示完整衣壳，白色箭头表示空衣壳；白色箭头标示蛋白聚集体。比例尺=200 nm。

实验室切向流过滤 Minimate EVO

Cytiva针对科研级别大体积超滤场景的解决方案——Minimate EVO。这是一款专为实验室级别设计的切向流过滤 (TFF) 系统，搭配个性化膜包，可覆盖毫升级到升级的样品超滤浓缩、换液。

优势：

多：处理量最高可至1 L，减少频繁离心操作。
快：滤速快，不易堵。
好：样品质量好，回收率高，死体积小。
省：膜包可重复利用，更节省成本。

应用场景：

柱层析前样品制备
回收/除去病毒
富集外泌体
蛋白质、肽和核酸浓缩脱盐
回收细胞裂解液中抗体和蛋白

膜包选型规则：

病毒应用中的截留分子量选择：

截留分子量	膜标称孔径*	病毒或颗粒直径
100 K	10 nm	30-90 nm
300 K	35 nm	90-200 nm
*标称孔径是指电镜显微镜下具体测量的结果。

针对病毒纯化或是其他实验室过滤场景中，各位老师如果有想了解，可以在评论区分享您的问题，我们会在后续的推文中为您解答。我们还会在提问的老师中抽取幸运锦鲤送出Cytiva的官方周边，快来互动吧！

教学课程

市场活动

资料下载

产品