一次性层析系统ÄKTA ready 450，让AAV纯化更passion！

腺相关病毒（AAV）

据ClinicalTrials.gov网站数据显示，目前全球有超过300项AAV基因治疗相关的临床试验正在进行，这些试验涵盖了遗传性眼病、神经肌肉疾病、心血管疾病等多种疾病领域。

然而，长久以来，产能问题都阻碍着AAV的大规模应用，是其转变为更经济、更易被普罗大众承受的疗法之路上的关键瓶颈。

大规模生产腺相关病毒（AAV）面临的挑战中，下游纯化过程尤为关键。AAV下游工艺包括从工艺和产品相关杂质中纯化病毒颗粒，去除宿主细胞、质粒 DNA 和空壳病毒等杂质。

近年来，已经开发出了纯化 AAV 载体的步骤，但下游工艺占病毒生产总成本的很大一部分，因此需要更具有成本效益地生产AAV，采用一种有效且可重复的方法来生成高纯度的病毒载体（见图1）。

图1：rAAV的生产工艺概览

(源自DOI:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.03.016)

氯化铯(CsCl)/碘克沙醇密度梯度离心是最传统的AAV纯化技术。这种技术适用于所有血清型且分辨率高，但是因生产工艺很难放大，低通量等缺点阻碍了其在工业中的应用。

继密度梯度离心之后，层析法不断发展，并逐渐成为一种成熟的、主流的方法。层析法通过载体的净电荷、疏水性、对配体的亲和性、大小以及其他性质来分离并纯化载体。这类技术有诸多的优点：

更具可扩展性和成本效益；
可多次重复使用；
可并行运行或串联运行；
还可有效去除非定植剂，这是开发后期的一个关键方面。常见的包括亲和层析以及离子交换层析。

AAV下游纯化工艺中最常见的第一步是使用亲和层析法从细胞裂解物中捕获衣壳。

在捕获阶段，亲和层析无法区分完整病毒与空壳病毒；基于两者细微的电荷差异，空壳病毒的去除更大程度上依赖于精纯步骤的阴离子交换层析，该方法的复杂性在于空衣壳和完整衣壳的电荷差异非常窄，病毒颗粒的差异洗脱只有通过非常缓慢且平坦的线性氯化钠梯度来实现。

成功区分开时，会得到两个彼此非常接近的洗脱峰（见图2）。因此，这一工艺对层析系统的梯度性能尤其是梯度精度具有较高的要求。

图2：AAV IEX线性梯度洗脱曲线

此外，在空壳和实心载体洗脱的过程中，需要时刻同时关注UV260 nm和280 nm洗脱峰的变化，通过两者的比值变化来判断空衣壳分离和洗脱效果。

适合AAV GMP纯化的

一次性层析系统ÄKTA ready 450

在AAV大规模生产中，纯化过程需要处理大量的病毒颗粒，这不仅增加了操作的复杂性，还对纯化技术和设备提出了更高的要求。针对以上AAV病毒载体GMP下游纯化的特点，Cytiva ÄKTA ready 450一次性层析系统在设计时从硬件和软件层面做了充分考量，贴合AAV纯化的需求。

1.

低至40 ml的流路保留体积，让高价值AAV产品充分回收

ÄKTA ready 450具有紧凑的流路和系统硬件设计，占地尺寸仅为558*640*940 mm，主流路采用3.2 mm内径一次性流路管路（其中入口管路为4.8 mm），在双泵梯度流路中，除气泡陷阱外，系统流路总体积约40 ml，对于价值较高的AAV产品，实现最大的回收率，减少产品损失。

图3：ÄKTA ready 450流路图和一次性流路模拟图

2.

高精度一次性QF隔膜泵和流速/电导反馈调节，实现更好的梯度分离效果

ÄKTA ready 450采用一次性QF隔膜泵，可实现5-450 ml/min内精准流速控制，隔膜泵前配置了2个高精度非接触式超声流量计，流量计精度±2% ，在整合到系统中考虑温度，黏度等影响因素，回路流速精度±6%或12 mL/min取高值（见表1）。

表1：FT-142流量计纯化水流速测试示例

系统流速设定值 Flow ml/min	流量计读值 Read value ml/min	真实测量值 True value ml/min
450	449	459
225	225	232
5	5	5

系统还配置泵后电导检测器，除了依靠泵自身的流速控制外，还可通过UNICORN软件算法实现电导反馈或流速反馈调节两泵流速比例，实现更好的梯度精度。用户可以根据实际工艺溶液灵活选择流速反馈或电导反馈模式，在此条件下可实现优于±3%梯度精度（见图4）。

图4：在15℃-30℃ 1 M NaCl水溶液电导反馈调节下，系统梯度鱼骨图

在进行AAV纯化时，需要在低盐氯化钠溶液条件下拉缓慢且平坦的梯度工艺进行洗脱分离，在ÄKTA ready 450上，图5展示了流速控制低盐梯度洗脱示例，通过电导梯度反馈可以得到更佳的梯度精度。

图5：ÄKTA ready 450线性梯度AAV洗脱

3.

实时显示UV260 nm/280 nm比值

在ÄKTA ready 450的控制软件UNICORN中：

可以在系统控制界面实时显示当前曲线中的UV260 nm/280 nm处吸光度比值，帮助判断当前空壳和实心病毒颗粒的洗脱。

在方法编辑界面，可以通过UNICORN高级编程，设置260 nm/280 nm吸光度比值的Watch RatioUV逻辑命令，自动监测判断切换收集口进行产品的收集，实现工艺的全自动控制。

还可以在Evaluation界面中调出比值曲线，在结果图谱中进行分析整理。（见图6）

图6：UV比值的实时显示示例

4.

可放大性

ÄKTA ready一次性平台提供广泛的符合GMP要求的文档包，包括所有过流部件符合USP <88> Class VI材质证明、无动物源性(ADCF) 或符合欧盟EMA/410/01证明文件。统一的UNICORN平台允许不同系统之间进行对接，便于工艺参数的转移，帮助更好实现层析工艺放大。

图7：可放大的ÄKTA ready 一次性层析平台

总结：AAV大规模纯化需要高效且可扩展的层析技术和设备，以确保能够从复杂的细胞培养基质中分离出高纯度的AAV颗粒。

ÄKTA ready 450具有以下多个优势：

较小的流路保留体积，最大化产品回收；
高精度的流速和梯度精度控制，实现更好的分离效果；
较小的流路保留体积，最大化产品回收；
可放大的一次性平台，灵活匹配多种规模；
可以帮助实现灵活可扩展的AAV GMP下游生产。

除此之外，AAV的大规模纯化过程中的质量控制也更为复杂。

需要精确监测和控制每一个步骤，确保最终产品的纯度、活性和安全性。这不仅涉及到技术上的挑战，还包括对生产过程中可能出现的变异和污染的严格监管，ÄKTA ready 450提供带AQ无菌快接头一次性伽马辐照灭菌流路，可实现生产的全封闭操作，最大可能减少生物负载和污染风险。

最后，大规模纯化还面临着成本控制的压力。

随着生产规模的扩大，纯化步骤的成本也会显著增加，这直接影响到基因治疗产品的最终价格。

这些问题在病毒载体一次性生产技术应用的讨论中也多有分析，请参考👇：

全新ÄKTA ready 450 — 赋能小规模GMP生产之病毒载体篇