手把手带你做实验｜ÄKTA离子交换层析手动操作+方法设置全攻略

一、实验前准备

二、离子交换层析的手动操作

（关键！避免结果丢失）

正确操作步骤：

点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions在打开Manual instructions对话框中选择Save result as后的Browse按钮，选择要保存的路径及名称，点击OK。

点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Alarm，根据层析柱参数，设置Alarm system pressure和Alarm pre column pressure（本案例均设为0.5 MPa），点击Insert；如有Alarm delta column pressure则进行设置。

点击Flow Path→Column position，在下拉框选择柱子连接的位置；在Flow Direction复选框，选择溶液流向（一般选Down flow自上向下运行），点击Insert；如无柱位阀则无需进行设置。

点击Pumps→System flow，输入柱子推荐流速（如HiTrap Capto Q, 1mL层析柱推荐流速为1 mL/min），同时设置管路A1，点击Insert→Execute。

点击Monitor→Wavelength，选择需要监测的波长，点击Insert→Execute；无需使用的波长，勾选后面的Off复选框关闭即可。（注意：单波长设备或仅需280 nm检测时，可跳过此步）。

点击Execute，系统开始运行，层析柱进入平衡状态，此时Process Picture中会以绿色标识运行流路。

⚠️ 小提醒：

在上样阀的LoopF和LoopE口，连接样品环（如0.5 mL）。

用注射器抽取缓冲液，连接到上样阀的Syr口，推入缓冲液清洗样品环，可重复几次，确保清洗彻底。

清洗完成后，用注射器吸取样品（重点：吸取的样品体积必须大于上样环体积）。

排除注射器内的气泡，将注射器连接到上样阀的Syr口，推入样品（重点：推入体积稍大于上样环体积，确保无气泡）。

⚠️ 注意：

点击Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Injection valve，将上样阀选择为Inject，点击Insert→Execute。

注：收集命令可根据目的分子的性质，实验采用流穿模式或结合洗脱模式在不同步骤选择收集。

上样运行1.5 ml后，点击Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Manual load，将上样阀切回Manual load，点击Insert→Execute。

点击Manual→Execute Manual Instructions→Gradient→选择洗脱使用B液浓度target为100%，洗脱时间length为20 min（可根据流速选择梯度时间，初次实验推荐0-100% B , 20 CV），点击Insert→Execute。

点击Manual→Execute Manual Instructions→Gradient→选择洗脱使用B液浓度target为100%，洗脱时间length为0 min，点击Insert→Execute。运行5 CV。

点击Manual→Execute Manual Instructions→Gradient→将B液浓度的target改为0%，洗脱时间length为0 min，点击Insert→Execute。运行5 CV。

观察仪器界面，待紫外峰与电导峰均平稳，点击工具栏中的结束图标，停止实验即可。

将缓冲液A1的入口放入去离子水中，执行Pump wash命令。点击工具栏Manual Execute Manual Instructions→Alarm，分别设置Alarm system pressure和Alarm pre column pressure为0.5 MPa和0.5MPa，点击Insert。

点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Column position，在下拉框中选择柱子需要连接的位置，在Flow Direction复选框中选择溶液流向Down flow或者是Up flow（一般选择Down Flow，自上向下运行），点击Insert；如无柱位阀则无需进行设置。

点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions →Pumps→System flow，输入层析柱推荐的流速为1 mL/min，点击Insert。

点击Execute一起执行相应的命令，即可开始用水清洗层析柱，运行2个柱体积之后，点击工具栏暂停图标，暂停。

将缓冲液A1的入口放入经脱气的20%乙醇中，继续运行，再次执行Pump wash命令。

待泵冲洗结束后，机器会自动继续之前1 ml/min的流速，用20%乙醇溶液清洗柱子，运行2个柱体积后，完成层析柱的保存。

三、离子交换层析的方法设置

接下来，我们将抛开晦涩的参数解释，用一步不踩雷的实操方式，手把手教你在ÄKTA中完成方法创建，让自动化真正为你的目标蛋白服务。

打开Method Editor界面，点击Create a new method图标（如下图），选择Predefined Method中下拉框选中Anion Exchange Chromatography (AIEX)，点击OK。

分别对方法进行设置，根据HiTrap Capto Q, 1 mL层析柱的说明书和实验的运行流程设置方法，方法编辑界面如下图，根据所选的AIEX实验，整个试验过程包括Equilibration>Sample Application>Column Wash>Elution>Column Wash>Equilibration六步。

修改Method Settings中参数。点击Method Phase下的Method setting, 即可进入Method setting界面设置。在界面选择Column type为HiTrap Capto Q，1 mL，选择之后系统会自动出现该层析柱的Column Volume, pressure Limit pre- column，Pressure Limit delta- column，Flow Rate等参数。Column Position选择层析柱连接的柱位，如下图选择3号位。在Monitor setting处根据需求选择需要检测的紫外波长，系统默认使用280 nm检测，如需开其他波长（如260 nm）, 可勾选UV2，并输入相应波长即可。根据层析柱和设备的不同配置设置参数，如无柱位则无需设置。

点击Equilibration进入平衡阶段设置，平衡流速、缓冲液入口不变，平衡时缓冲液B所占的比例为0%，输入平衡体积5 CV。

点击Sample Application进入上样阶段设置，选择Loop type为Capillary loop，输入Empty loop with（清空样品环）的体积1.5 ml（此方法使用0.5 mL样品环，设置3倍样品环体积为了完全清空样品环内样品）。

点击Column Wash进入柱冲洗阶段设置，选择冲洗使用B液浓度0%，冲洗的溶液体积为5 CV。

点击Elution进入洗脱设置，保持洗脱流速、缓冲液入口以及缓冲液流向不变。设置使用线性洗脱，在20 CV之内B浓度升至100%，并在Fractionation Setting中选择Fraction Collector用收集器进行固定体积收集，每管收集1 mL。

点击Column Wash进入下一步柱冲洗阶段设置，此阶段目的是对层析柱进行彻底清洗。 设置清洗缓冲液为100% B，冲洗体积为5 CV。

点击Equilibration进入层析柱再平衡阶段设置，此阶段目的是将层析柱中的缓冲液置换为平衡缓冲液。设置平衡体积为5 CV。

保存编辑的方法点击工具栏上保存图标（如下图），在弹出的窗口中选择存储位置及名称，点击Save即可保存方法。

四、实验结束后的系统的清洗和保存

• 点击工具栏Manual→Execute Manual Instructions→Pumps→System flow, 输入层析柱推荐的流速为1 mL/min，点击Insert并点击Execute执行。
• 将层析柱从设备上拆下（拆柱过程需要先拆下端，后拆上端，拧下接头后及时用堵头堵上）。
• 点击Manual→Execute Manual Instructions→Flow Path→Outlet valve，在下拉框中选择出口为Frac，点击Insert之后点击Execute执行，以清洗出口阀至收集器的管道。

⚠️ 注意：

• 运行一段时间（约2-3 min即可）后点击工具栏的结束图标， 结束层析柱及系统的清洗和过程。

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