膜蛋白研究“芯”发现：L1芯片的多种玩法

传感器芯片是Biacore SPR系统的核心，提供产生SPR信号所需的物理条件。我们想要研究的相互作用发生在传感器芯片的表面。Biacore分析的特异性取决于附着在传感器表面的分子的性质和特性。

我们一般可以使用三种不同的方法将生物分子附着到传感器芯片表面：

          分子通过共价键连接到表面；

          目标分子通过与另一个分子（通常本身通过共价固定附着）的非共价相互作用附着；

          利用疏水相互作用附着目标分子或疏水性载体（如脂质双层）到传感器芯片表面。

Biacore为客户提供超过20种（预制+Kit）芯片表面，满足不同的应用需求。

Sensor Chip L1的表面由羧甲基化葡聚糖基质组成，该基质经过亲脂性基团修饰，用于捕获含有或不含膜蛋白的脂质囊泡。

结合过程涉及囊泡扩散到表面，以及Sensor Chip L1上的亲脂性结构掺入脂质膜中，非共价锚定囊泡。我们可以通过Sensor Chip L1上的疏水相互作用非特异性地捕获脂质体、纳米盘（nanodiscs）和其他脂蛋白颗粒。该表面为脂质膜的附着提供了位点，同时保持了CM类型传感器芯片的亲水表面特性和共价固定潜力。

确保Biacore SPR仪器得到适当维护和清洁，并且在dock Sensor Chip L1之前去除其他分析中使用的所有去污剂痕迹。建议对所有仪器进行以下清洁程序作为常规。使用dock在仪器中的空白Sensor Chip CM5或维护芯片运行该程序：

用于吸附在Sensor Chip L1上的脂质体应使用标准脂质体制备技术在运行缓冲液中制备。相对于磷脂，0.5 mM的浓度通常就足够了。吸附到Sensor Chip L1的速率不受脂质体大小的显著影响。膜相关蛋白和跨膜蛋白都可以掺入脂质体中。

用至少两次、30秒的去污剂注射清洗表面，例如水中的20 mM CHAPS（3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐）或40 mM辛基葡萄糖苷，或用1份异丙醇和3份50 mM NaOH的混合物清洗。彻底清洗针头和流动系统（包括IFC中的样品线）非常重要；

以低流速（2至10 μL/min）注入脂质体制备物。通常在几分钟内即可实现足够的脂质体吸附。吸附表现为响应的增加，当表面覆盖接近完成时趋于平缓。在脂质体制备物流过后，让缓冲液流过表面5至10分钟以稳定脂质体层的形成；

对于用纯脂质体制备的表面，可以使用短时间注射10至100 mM NaOH来去除松散结合的结构并稳定基线。注意：此处理可能会损坏含有添加剂（如胆固醇、神经酰胺或蛋白质）的脂质体；

在分析开始时进行几次缓冲液或再生溶液的空白注射以稳定表面。

根据脂质体组成、缓冲条件和温度，脂质体可能会在葡聚糖基质上融合，形成部分或完全覆盖传感器表面的支撑脂质双层。通常，未融合脂质体的表面吸附容量超过10,000 RU，而融合的脂质双层在某些情况下产生的响应在5,000 RU左右。

融合并释放多余脂质的过程，可能在脂质体吸附后表现为响应值的向下漂移。在注入样品之前可能需要等待响应稳定。

表面重构（On-surface reconstitution，OSR）是一种在传感器表面上以去污剂溶解形式固定化膜蛋白后，在其周围重新建立脂质环境的方法。与将脂质体吸附到Sensor Chip L1相比，这种方法的主要优势在于蛋白质配体是固定化或附着在表面上的，而不是被动携带在吸附的脂质体中，通常提供更高的潜在配体容量，并允许更好地控制固定化特性，如配体密度和取向。该方法适用于重构跨膜蛋白（如G蛋白偶联受体[GPCR]）周围的膜环境[1]。

为了实现OSR，首先将去污剂溶解的配体固定化或捕获在Sensor Chip L1的两亲性表面上，然后立即暴露于混合的去污剂-脂质胶束注射。胶束自发吸附到传感器表面上的亲脂性残基和配体上的疏水域上。随后去污剂从表面洗脱到缓冲液流中，留下富含配体的重构脂质双层（图1）。

用于OSR的运行缓冲液应不含去污剂，以允许去污剂从表面洗脱和脂质膜的重构。为避免将固定化的配体暴露于无去污剂缓冲液，如果可能，混合胶束的注射应在配体注射后直接进行，中间不中断运行缓冲液，这可以通过使用连续注射（Dual Command）来实现。

配体应使用具有高临界胶束浓度（CMC）的去污剂（如辛基葡萄糖苷）溶解，这种去污剂可以在运行缓冲液中相对容易地洗脱。如果配体浓度足够高，通常可以直接从溶解的细胞提取物的上清液中捕获配体到传感器表面，无需额外的纯化步骤。共价固定的配体必须首先以去污剂溶解的形式富集。

混合胶束在运行缓冲液中制备，通常通过将干燥的脂质制备物溶解在缓冲液-去污剂混合物中。胶束中去污剂和脂质的比例对OSR的成功很重要，并由去污剂的CMC和脂质在给定缓冲液和温度条件下的溶解度决定。最佳比例差异很大，通常必须根据经验进行微调。

对于由辛基葡萄糖苷和POPC组成的胶束，在HBS缓冲液中发现的最佳混合物是7.5 mM辛基葡萄糖苷和3.75 mM POPC。重要的是混合胶束制备物不浑浊（浑浊表明存在囊泡），因为这将导致囊泡捕获而不是膜重构。过量的脂质通常会导致囊泡形成并产生浑浊，而过量的去污剂会损害混合胶束在表面的吸附。

制备混合胶束的推荐程序如下。为了优化脂质-去污剂比例，在建议的浓度范围内准备脂质和去污剂各五种浓度，总共25种脂质-去污剂比例。请注意，脂质和去污剂浓度都需要优化。

最佳脂质-去污剂比例是在测试注射中给出最高响应的澄清溶液（图2）。对于POPC胶束，预期响应比基线高约3,000至6,000 RU。水平可能因其他脂质体类型而异，例如，阴离子脂质通常给出较低的响应水平。

捕获方法通常更可取，因为配体注射可以紧接着混合胶束注射。共价固定方法在某些情况下可能有效，前提是配体制备物中的去污剂不干扰固定化化学，并且所有清洗和偶联溶液都包含去污剂以保持配体活性。通常，与吸附含配体的脂质体相比，使用OSR更容易实现更高的配体水平（分析物结合容量）。

将混合胶束制备物在去污剂溶解的配体附着到表面后，通过短时间（通常1至2分钟）注射流过表面，然后使用无去污剂运行缓冲液洗脱去污剂并重构膜。

为使用Biacore SPR系统分析而制备脂质体和膜蛋白时可使用的策略大致可分为：

捕获带标签或生物素化的膜蛋白作为附着方法正变得越来越普遍。当使用天然膜制备物时，这也增强了附着的特异性。处理膜蛋白时有用的亲和标签包括His标签或1D4标签。

在处理去污剂溶解的蛋白质时，在运行缓冲液中添加去污剂可能有助于防止蛋白质功能丧失。为避免传感图假象，通常在运行缓冲液中添加的浓度低于用于溶膜的缓冲液。

另一方面，在类膜环境中的分析需要无去污剂运行缓冲液，因为去污剂可能干扰脂质结构。类膜环境包括例如蛋白脂质体、重构膜、nanodiscs、Salipro技术、病毒样脂蛋白颗粒（VLPs）和苯乙烯马来酸脂质颗粒（SMALPs）。

Biacore作为被中美日等多国药典收录的分子互作检测“金标准”之一，已广泛应用到基础科研与药物开发的多个领域。截至目前，借助Biacore累计发表的文章已突破68000篇，超过100种的已上市药物的研发、申报、生产过程中也均有Biacore的身影。同样期待越来越多骨科相关疾病的治病机制被发现、药物被开发，造福临床，造福人类。